宋 杰

前言

熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ Hybridization，簡(jiǎn)稱FISH)的原理是以核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原則為基礎(chǔ)所發(fā)展出來的檢測(cè)技術(shù)，主要是利用DNA序列的互補(bǔ)性，通過熒光標(biāo)記的DNA探針與預(yù)處理的待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù)，即可對(duì)細(xì)胞、組織樣本中的染色體或基因異常進(jìn)行檢測(cè)和診斷。

FISH用于特定核酸序列在不同組織結(jié)構(gòu)中的定位，已經(jīng)有20多年的研究歷史。目前FISH技術(shù)應(yīng)用范圍越來越廣，技術(shù)不斷完善改進(jìn)。盡管FISH技術(shù)的基本原理非常簡(jiǎn)單，但是高靈敏度的檢測(cè)、多個(gè)物種間的同時(shí)檢測(cè)、自動(dòng)化數(shù)據(jù)獲取和分析等技術(shù)都得到了很大的改進(jìn)和提高。關(guān)鍵性檢測(cè)環(huán)節(jié)的改進(jìn)獲得了低背景雜交探針，同時(shí)也突破了對(duì)多個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行定位和分析的技術(shù)難題。FISH流程的完善和多色FISH的多位點(diǎn)檢測(cè)進(jìn)一步擴(kuò)大了FISH技術(shù)檢測(cè)核酸的范圍。FISH技術(shù)操作程序的簡(jiǎn)化和檢測(cè)靈敏度的提高，使得FISH技術(shù)從原先的一種次要檢測(cè)手段日益轉(zhuǎn)變成一種首要的生物學(xué)核酸檢測(cè)技術(shù) 。由于技術(shù)本身操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、具有較高的靈敏性及特異性，因此很適應(yīng)臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)。在近幾年里，F(xiàn)ISH有了日新月異的發(fā)展。

目前，隨著環(huán)境污染的不斷加重，近幾年流產(chǎn)有增高趨勢(shì)。遺傳學(xué)家對(duì)大量流產(chǎn)兒進(jìn)行了與遺傳有關(guān)的細(xì)胞核內(nèi)染色體的研究。發(fā)現(xiàn)50%-60%的流產(chǎn)兒，具有異常染色體，這種染色體異常，包括數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常。正由于這些染色體異常而導(dǎo)致了胚胎發(fā)育的障礙，造成妊娠中斷。導(dǎo)致胎兒染色體異常的原因主要有兩種：一種是環(huán)境中的致畸胎因素，如放射線、病毒和某些藥物等。各種致畸胎因素作用于生殖細(xì)胞和處于早期發(fā)育的胚胎，導(dǎo)致胎兒染色體異常。另一種是胎兒父母的一方或雙方染色體異常，這些染色體異常的父母，往往從外表上看是正常的，并沒有發(fā)育上的缺陷，而細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)卻發(fā)生了明顯變化，他們?cè)杏呐咛ズ艽笠徊糠譃槿旧w異常的胎兒。染色體異常的攜帶者相當(dāng)多，大約每二百五十對(duì)夫婦中就有一個(gè)。在習(xí)慣性流產(chǎn)的病人中，夫婦一方或雙方存在染色體異常的約占10%。因此，對(duì)人中期染色體異常檢測(cè)就成為臨床細(xì)胞遺傳學(xué)研究中重要部分。

然而在臨床細(xì)胞遺傳學(xué)研究中，常規(guī)的染色體顯帶技術(shù)常常存在難以分辨染色體缺失、重復(fù)及復(fù)雜、細(xì)微的相互易位等問題，染色體熒光原位雜交是在細(xì)胞水平上的一種分子技術(shù)手段，染色體熒光原位雜交技術(shù)是80年代在放射性原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。該技術(shù)與FISH技術(shù)的結(jié)合為人類染色體畸變的研究提供了更為精確可靠的診斷依據(jù)。因而FISH技術(shù)已廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷、腫瘤生物學(xué)以及哺乳動(dòng)物染色體進(jìn)化等研究領(lǐng)域，成為醫(yī)學(xué)臨床診斷中一種重要的技術(shù)手段。

本實(shí)驗(yàn)將利用人的全套染色體探針，通過熒光原位雜交技術(shù)，對(duì)人中期染色體異常進(jìn)行檢測(cè)。

一、染色體的制備

1.收獲細(xì)胞：用吸管吸取培養(yǎng)物，移至離心管中，以800～1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄去上清液，留下沉淀物約0.5 ml。

2.低滲處理：加入預(yù)溫37℃的低滲液至4 ml，用吸管輕吹打混勻，置于37℃恒溫水浴鍋中低滲20分鐘，促使白細(xì)胞膨脹，染色體分散。（操作時(shí)，要注意不要將細(xì)胞吸到吸管上部，也不要接觸離心管的上部，否則會(huì)丟失許多細(xì)胞。）

3.預(yù)固定：低滲處理后，沿管壁緩緩加入1ml新配制的固定液（甲醇：冰乙酸=3:1），立即用吸管輕吹打混勻。以800轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清液，留約0.5ml沉淀物。

4.固定液：加入新鮮固定液至5 ml，吸管吹打混勻，室溫固定20分鐘，離心，去上清液。依上方法再重復(fù)固定兩次。（固定液要新鮮配制，否則會(huì)形成酯類，影響固定效果。）

5.制備細(xì)胞懸液：離心后預(yù)留0.2～0.3 ml固定液或另加新鮮固定液（視細(xì)胞多少而定），用吸管吹打混勻，制成細(xì)胞懸液。

二、常規(guī)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析（染色體顯帶）

（一）G－顯帶

先用空氣干燥法將中期分裂相滴在酒精浸泡并且用紙擦干凈的玻片上，然后將其放入65℃的通風(fēng)烤箱中烤片3－5小時(shí)老化片子（必要時(shí)可以烤片過夜12－24小時(shí)），接著用0.005%-0.01%的胰酶/1×PBS液處理染色體玻片標(biāo)本2－5分鐘（胰酶的濃度和處理的時(shí)間視不同物種和染色體標(biāo)本的狀態(tài)可以調(diào)整），最后于Giemsa染色液中（Giemsa原液：KH2PO4緩沖液＝1：6稀釋，pH＝6.8）染色體3－5分鐘，水沖洗干凈，室溫空干或者用吹干，顯微鏡下觀察，對(duì)較好的G－帶分裂相拍照，并且做進(jìn)一步的分析。

（二）熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization）

染色體玻片標(biāo)本預(yù)處理：通常為了取得比較好的雜交效果，要預(yù)處理染色體玻片標(biāo)本以去除中期分裂相上面和周圍覆蓋的細(xì)胞質(zhì)和其他可以影響有效雜交的物質(zhì)。

將中期分裂相的懸液滴在玻片上，等分裂相干后，在顯微鏡底下觀察，如果分裂相周圍為比較明顯的一層物質(zhì)所籠罩，則需要下面的處理步驟。

胃蛋白酶處理：0.002-0.005%的胃蛋白酶溶液（0.01N HCl）處理3－5min

過兩次2×SSC，每次3min，最后由梯度乙醇脫水（70%－90%－100%），每次2min，空干，最后放入65℃的通風(fēng)烤箱老化片子60－90min再由70%甲酰胺變形染色體標(biāo)本DNA。

（三）染色體玻片標(biāo)本的變性和雜交

63－68℃水浴預(yù)熱70%甲酰胺變性液，將玻片放入其中變性1－2min，立即轉(zhuǎn)入－20℃70%冰乙醇中1min；再經(jīng)梯度乙醇（70%－90%－100%）脫水；空氣風(fēng)干后將經(jīng)過變性和預(yù)退火的探針混合液加到玻片上有中期分裂相的區(qū)域，用22×22蓋玻片覆蓋，用鉛筆頭小心的趕出蓋玻片下的氣泡，用膠水封好蓋玻片的邊緣后，放置在雜交盒中37℃避光雜交12－48小時(shí)（近緣物種12－24小時(shí)，遠(yuǎn)緣48小時(shí)或者更長(zhǎng)）。

3.雜交后洗滌

在42-45℃的50%甲酰胺/2×SSC溶液和2×SSC溶液中洗滌兩次，每次5 min；在4×T(4×SSC和0.05% Tween-20)溶液中溫育5min后，將4×T液配制的抗體加在玻片上（單色用biotin－16－dUTP標(biāo)記的探針用Cy3-avidin抗體檢測(cè)，1:1000稀釋）；在37℃濕潤(rùn)暗盒中反應(yīng)20min后，再經(jīng)37℃4×T溶液中換洗三次，每次5min。玻片標(biāo)本經(jīng)0.1μg/mlDAPI溶液復(fù)染，以抗淬滅劑AF1(Citifluor Ltd)封片。

（四）圖像觀察、拍照與處理

用安裝有CCD攝像頭的ZEISS Axioskop熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)，通過Genus 圖像處理軟件(Applied Imaging公司)控制拍攝并進(jìn)行圖像分析。根據(jù)染色體的DAPI帶型和G-帶型，將熒光信號(hào)在染色體上進(jìn)行定位。

三、結(jié)果與分析

人的22條常染色體探針以及X，Y性染色體探針在待檢測(cè)人的中期染色體分裂相上都檢測(cè)到信號(hào)。圖1是人的13，15號(hào)染色體探針與待檢測(cè)人中期染色體雜交的示意圖。圖中紅色亮點(diǎn)即為人的染色體特異探針與染色體標(biāo)本雜交的部位。從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，人的染色體特異探針除了與待檢測(cè)標(biāo)本的一對(duì)同源染色體雜交外，并未在其他染色體上檢測(cè)到紅色信號(hào)。這說明此人13號(hào)和15號(hào)染色體無異常。同理，我們將人的其他染色體探針與待檢測(cè)人中期染色體進(jìn)行雜交，并未發(fā)現(xiàn)染色體異常情況。

四、討論

染色體顯帶雖然是細(xì)胞遺傳學(xué)分析不可缺少的基本手段，但喲內(nèi)該法所得結(jié)果的可靠性取決于收獲的中期有絲分裂相數(shù)量，染色體分散和顯帶的質(zhì)量，甚至在很大程度上取決于分析者的經(jīng)驗(yàn)，即使分析者很有經(jīng)驗(yàn)，對(duì)一些復(fù)雜或較小的畸變也難免作出錯(cuò)誤或模糊的而FISH 技術(shù)的基本原理是用已知的標(biāo)記核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸[4]。FISH 的探針穩(wěn)定，操作安全，只須4-6h雜交，能夠直接在染色體上定性、定量標(biāo)記，通過堿基互補(bǔ)來保證反應(yīng)的特異性。在過去的15 年中，F(xiàn)ISH 技術(shù)因其與經(jīng)典的細(xì)胞遺傳學(xué)相比能更有效的對(duì)基因重排、缺失和重復(fù)進(jìn)行分析，所以在染色體分析中扮演著重要的角色。熒光原位雜交技術(shù)（FISH），該技術(shù)不僅可用于中期分裂相，還可在間期細(xì)胞顯示雜交信號(hào)，尤其適用于那些培養(yǎng)難以成功的各種組織細(xì)胞。此技術(shù)是一種具有高度靈敏性和特異性的染色體分析技術(shù)，可廣泛用于各種染色體異常的檢測(cè)。

通過我們的實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為用FISH檢測(cè)只需觀察不同顏色的信號(hào)的數(shù)目即可做出正確的診斷。既可以分析中期分裂相又可以檢測(cè)間期細(xì)胞，故其所分析的細(xì)胞數(shù)目要比常規(guī)染色體分析的多10倍之多。容易檢測(cè)出低比例的嵌合體。因而做出的結(jié)論更準(zhǔn)確。尤其是在中期分裂相不多的時(shí)候更體現(xiàn)出FISH的優(yōu)越性。在診斷應(yīng)用中染色體涂染已發(fā)展成為一個(gè)不可或缺的工具，特別是最近染色體涂染彩色核型分析的成熟，現(xiàn)在能應(yīng)用于雜交為基礎(chǔ)的核型分析，并應(yīng)用于檢測(cè)染色體畸變的初步篩選試驗(yàn)。在臨床和癌癥細(xì)胞遺傳學(xué)中的大多數(shù)標(biāo)記染色體很有可能將易于識(shí)別。

總之，本文利用人的染色體特異探針，建立了一套穩(wěn)定的FISH技術(shù)方法。FISH與常規(guī)的染色體顯帶分析法相比，有如下優(yōu)點(diǎn)：快速、不需體外培養(yǎng)、在極短的時(shí)間內(nèi)可檢測(cè)大量細(xì)胞；可對(duì)那些分散不好的分裂相作出明確診斷；能分析一部分顯帶染色體技術(shù)不易分辨的異常，如復(fù)雜易位、倒位、微小缺失、復(fù)雜畸變等；敏感性和特異性非常高。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)可廣泛應(yīng)用于臨床染色體異常檢測(cè)中。

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