王貴花，徐運強，王榮霞

(石家莊市第二醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

我們模擬糞腸球菌在口腔內(nèi)的生存環(huán)境建立根管感染模型，檢測黃連，大黃，五味子，連翹四種中藥水煎劑對糞腸球菌的抑菌活性，并對本次實驗方法進行評價。

1 材料和方法

1.1 中藥水煎劑的制備 黃連，大黃，五味子，連翹四種中藥(購自河北省藥材公司)各50g，分別加水文火煎至200ml成為濃度為0.25g/ml的藥液，過濾備用。

1.2 菌株及菌懸液的制備 收集石家莊市二院細菌室分離到的糞腸球菌臨床菌株共5株，來自醫(yī)院病人的各種標本(痰，尿，便，分泌物)，經(jīng)上海復(fù)星佰珞微生物鑒定及藥敏分析儀(FB450R1)鑒定為糞腸球菌。經(jīng)過鑒定的糞腸球菌使用牛心腦浸液(BHI肉湯)混合增菌后備用(BHI肉湯購自北京路橋)。菌種使用前先復(fù)蘇，再用BHI肉湯配成0.5麥氏濁度的標準菌液備用(透光度為80%T)。因BHI肉湯本身是淡黃色，調(diào)整菌液濁度時應(yīng)將本身的顏色除去。

1.3 樣本預(yù)備 收集新鮮單根管牙70顆，經(jīng)口腔科處理后，將牙根置于含有25ml BHI肉湯的試管中，1.1kg/cm2，121℃高溫、高壓滅菌 15min。

1.4 建立根管感染模型 用注射器把配制好的標準菌液分別注入70顆牙的根管中，再把牙根放到盛有標準菌液的試管中，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h后。取出牙根，用0.9%氯化鈉沖洗根管，無菌濾紙干燥根管，再用蠟把牙根固定于培養(yǎng)皿底部。為了創(chuàng)造厭氧環(huán)境，根管口一定要完全封閉。整個過程嚴格無菌操作。

1.5 殺菌效果觀察 將70顆牙根分成7組，每組10顆。分別為:陰性對照組，只加0.9%氯化鈉;甲醛甲酚(FC)組，黃連水煎劑組;五味子水煎劑組;大黃水煎劑組;連翹水煎劑組;陽性對照組，加菌液和0.9%氯化鈉溶液。用注射器把各種消毒液分別注入除陰性和陽性對照組牙的根管內(nèi)，將放置牙根的各組培養(yǎng)皿置于5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)。在3天和7天時分別取出5顆牙根，無菌操作，使用25#H型銼(日本MANI)去除根管內(nèi)消毒劑，以0.9%氯化鈉注射液沖洗、無菌濾紙干燥后，用慢速G鉆均勻磨取根管內(nèi)層牙本質(zhì)粉末，電子天平稱取4mg粉末，置于含有20ml BHI肉湯的無菌試管內(nèi)，在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72h后取出，用數(shù)字顯示比濁儀(100%T)(上海復(fù)星佰珞)測量肉湯的透光度并分別記錄2次的數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計軟件為SPSS 18.0，計量資料用(s)表示，因各組數(shù)據(jù)方差不齊，多組計量資料的組間比較采用秩和檢驗，實驗組之間的兩兩比較用SNK法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

中藥水煎劑在相同濃度和環(huán)境條件下，大黃組3天，黃連組7天，F(xiàn)C組7天組間無差別;陰性對照組7天，五味子組3天組間無差別;黃連組3天，F(xiàn)C組3天組間無差別，其余各組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義。四種中藥對糞腸球菌的抑菌活性見表1。

表1 四種中藥對糞腸球菌的抑菌活性比較(s)

表1 四種中藥對糞腸球菌的抑菌活性比較(s)

分組 3天 7天P 81.42 ±1.30 69.63 ±2.75 ＜0.05 FC 組 78.50 ±0.92 66.92 ±3.23 ＜0.05五味子水煎劑 70.58±0.51 61.67±1.07 ＜0.05黃連水煎劑 77.08±1.46 66.67±1.37 ＜0.05連翹水煎劑 51.02±1.28 37.57±2.24 ＜0.05大黃水煎劑 65.00±2.53 57.60±2.75 ＜0.05陽性對照陰性對照組49.70 ±1.07 37.33 ±1.27 ＜0.05

3 討論

糞腸球菌是導(dǎo)致根管治療失敗的重要原因，這點已經(jīng)得到臨床廣泛的認同。但由于糞腸球菌對抗生素極易產(chǎn)生耐藥性，所以現(xiàn)在人們已經(jīng)開始進行中藥用于治療根管內(nèi)糞腸球菌的體外實驗。

黃連具有廣譜抗菌作用，體外抑菌試驗證明它對革蘭氏陽性球菌的作用要比對革蘭氏陰性桿菌強，并且在低濃度時抑菌，高濃度時殺菌［1］。大黃也是有廣譜抗菌作用的中藥。連翹在體外有抗菌作用，它與黃連，黃芩組成的復(fù)方，體外抑菌比單用連翹時更強［2］。五味子有斂肺滋腎，澀精止瀉，生津斂汗的作用。有報道，五味子醇浸液在體外對金黃色葡萄球菌，白色葡萄球菌，和一些革蘭氏陰性桿菌有抗菌作用［3］;五味子煎劑對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用，對人型結(jié)核桿菌完全抑制［4］。人們對五味子的抑菌作用研究較少，對黃連，大黃，連翹用于根管治療的研究也不多。張洪波［5］等證實，對引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的糞腸球菌，黃連，大黃，五味子在體外高度敏感，連翹對該菌中度敏感。

我們使用離體牙根管制備根管感染模型［6］測定中藥的抑菌效果，把相同濃度的藥劑注入根管內(nèi)，以求最大限度的接近口腔環(huán)境和藥物使用途徑。通過取3天和7天的培養(yǎng)液進行比濁，測定培養(yǎng)液的透光度來確定中藥的殺菌效果。

因中藥本身有顏色，所以在中藥抗菌試驗中，使用比濁法的不多。一般比濁法是將中藥倍比稀釋，取相同的量加入肉湯中，然后再把一定量的細菌加入。培養(yǎng)一定時間后轉(zhuǎn)種至平板，以無細菌生長的最低藥物濃度作為該藥的效價［7］。因為牙根的特殊結(jié)構(gòu)，如果把菌液和藥液直接放入培養(yǎng)液中，細菌有可能進不到根管內(nèi)，所以必須把糞腸球菌和藥液用注射器注入根管，確保成功建立根管模型。因為已經(jīng)用瓊脂稀釋法做了這幾種中藥的預(yù)試驗，所以本實驗取相同濃度的藥劑進行比較。因比濁管底有牙本質(zhì)粉末存在，只能對上層液進行測定。要想得到更為準確的細菌量的變化，可以采用營養(yǎng)物質(zhì)消耗法［8］，根據(jù)BHI肉湯中蛋白質(zhì)含量的變化判讀菌量的變化。BHI肉湯在使用前測定蛋白質(zhì)含量并記錄，然后分別在3天和7天時先轉(zhuǎn)種上層液，再測定蛋白質(zhì)含量，那樣既確定了是否污染雜菌，又能得出消耗蛋白質(zhì)的精確數(shù)值，從而折算出細菌量的變化，從而對中藥水煎劑的效果做一個更準確的評價。

本實驗結(jié)果顯示，四種中藥水煎劑對糞腸球菌有不同程度的抑菌活性，黃連效果最好，其次是五味子和大黃，連翹的作用最差。對于連翹與黃芩，黃連組成的復(fù)方是否對糞腸球菌有抑菌作用有待于再次研究。本次試驗方法可行，試驗結(jié)果可信，可以為臨床應(yīng)用中藥進行根管治療提供實驗依據(jù)。

［1］梅全喜，畢煥新.現(xiàn)代中醫(yī)藥藥理手冊［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，1998:76－80.

［2］趙亦成，蔣紀洋.淄博本草［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，1995:354－355.

［3］余傳隆，黃泰康，丁志遵，等.中藥辭海［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1993:832－838.

［4］李錦開，梅全喜，董玉珍.現(xiàn)代中成藥手冊［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2001:567－568.

［5］張洪波，葛利江，楊宏軍，等.單味中藥多糖對奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌體外抑菌作用［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，22(3):791 －801.

［6］張海鷗，張安生，祝磊，等.五倍子提取物對感染牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌殺滅效果的體外研究［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2009，19(3):144－147.

［7］馬秀敏，周曉英，張立，等.天山堇菜提取物的體外抗菌實驗［J］.時珍國醫(yī)國藥，2004，15(8):470 －471.

［8］馬建鳳，劉華鋼，朱丹.中藥體外抑菌研究的方法學(xué)進展［J］.藥物評價研究，2010，33(1):42 －45.