陳鵬，吳限，陳曦

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

細(xì)胞粘附分子是一類介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的糖蛋白。粘附分子使白細(xì)胞、血小板等易于粘附于血管內(nèi)皮，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展。而與腦缺血炎癥損傷密切相關(guān)的細(xì)胞粘附分子主要為選擇素家族中的E－選擇素(E－selectin)。我們觀察了心腦通絡(luò)液對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織Es－mRNA表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)藥物 參考課題組前期研究成果［1］。

1.2 試劑及儀器 PT－PCR試劑盒(美國(guó)Promega);引物設(shè)計(jì)合成(大連寶生物公司);瓊脂糖(北京原平皓生物技術(shù)有限公司);DNA Marker DL2000(大連寶生物公司);水平電泳儀(北京六一儀器廠);DYY－8B;PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)艾本德);DL2000。

1.3 方法

1.3.1 分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為5組，即模型組、假手術(shù)組、步長(zhǎng)腦心通對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)、心腦通絡(luò)液高劑量組(簡(jiǎn)稱高劑量組)、心腦通絡(luò)液低劑量組(簡(jiǎn)稱低劑量組)，在造模成功48h后各取8只。高、低劑量組和對(duì)照組分別于術(shù)前5天至處死前，每天給予灌胃給藥，高、低劑量組均給予心腦通絡(luò)液10.71ml/kg/d(低劑量組給藥前將心腦通絡(luò)液用蒸餾水按1∶1稀釋);腦心通組給予腦心通0.33g/kg/d;假手術(shù)組、模型組則予等體積的的0.9%蒸餾水灌胃，1日1次。

1.3.2 模型建立 參照文獻(xiàn)［2］，建立腦梗死大鼠模型，于造模成功后48h檢測(cè)Es－mRNA表達(dá)的變化。

1.3.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

在造模成功48h后，檢測(cè)Es－mRNA表達(dá)的變化，按照試劑盒步驟進(jìn)行。

PCR擴(kuò)增引物:引物由大連寶生物公司設(shè)計(jì)和合成，引物序列以及引物特異性介導(dǎo)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織E－選擇素mRNA表達(dá)的影響，見(jiàn)表2及圖1。

表2 藥物對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織E選擇素mRNA表達(dá)的影響(±s)

表2 藥物對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織E選擇素mRNA表達(dá)的影響(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;治療組與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;高低劑量組與對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;高劑量組與低劑量組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01。

組別 n E－選擇素mRNA假手術(shù)組 8 0.43 ±0.07＊＊模型組 8 1.61 ±0.14對(duì)照組 8 1.28±0.10＊＊△△低劑量組 8 1.42±0.12＊＊△△#高劑量組 8 1.24 ±0.10＊＊△△●●

結(jié)果表明，與模型組比較，局灶性腦缺血48h時(shí)，假手術(shù)組E－選擇素mRNA的表達(dá)最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);給予心腦通絡(luò)液和步長(zhǎng)腦心通后，各治療組腦組織E－選擇素mRNA的表達(dá)均有不同程度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，以高劑量組降低最為顯著，低劑量組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);高劑量組與對(duì)照組比較差異具無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與低劑量組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);各治療組與假手術(shù)組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 E選擇素目的基因和內(nèi)參照β－actin電泳圖

3 討論

通過(guò)多年大量的臨床觀察，認(rèn)為氣虛血瘀、腦絡(luò)閉阻為本病發(fā)病的主要病機(jī)，其機(jī)理為虛在肝腎，損在精氣血，因虛致瘀，瘀阻腦絡(luò)，中風(fēng)乃作，中風(fēng)乃本虛標(biāo)實(shí)之證。且氣虛證候與瘀血證候貫穿病變之始終［3－4］。針對(duì)氣虛血瘀，腦絡(luò)閉阻的這一病機(jī)特點(diǎn)，我們采用補(bǔ)益氣血，活血化瘀為主要治法，選用心腦通絡(luò)液治療本病。方中君藥為黃芪，黃芪性甘，微溫，補(bǔ)氣升陽(yáng)。《本草逢原》:“能通調(diào)血脈，流行經(jīng)絡(luò)，可無(wú)礙于雍滯也”。太子參、菟絲子、當(dāng)歸、水蛭四藥為臣藥，當(dāng)歸甘辛，微溫，補(bǔ)血活血?！侗静菡?“當(dāng)歸，其味甘而重，故能補(bǔ)血，其氣輕而辛，故能行血，補(bǔ)中有動(dòng)，行中有補(bǔ)，誠(chéng)血中之氣藥，亦血中之圣藥……?！碧訁⑿愿?、微苦，補(bǔ)脾益氣?！讹嬈聟ⅰ?“補(bǔ)脾肺元?dú)猓购?，生津，定虛驚。”水蛭性咸，味苦平，破血逐瘀消癥。菟絲子性甘，味溫，補(bǔ)肝腎。川芎、赤芍、桃仁、紅花、地龍為佐藥。赤芍性苦，味微寒，歸肝經(jīng)，涼血，散瘀?！侗静菥V目》:“赤芍散邪，能行血中之滯?！钡佚埿韵蹋逗?，通經(jīng)活絡(luò)。川芎性辛，味溫，活血祛瘀。紅花性辛，味溫，活血通經(jīng)。桃仁性苦甘，味平，活血化瘀?！侗窘?jīng)逢原》:“桃仁入手、足厥陰血分，為血瘀血閉之專藥?？嘁孕箿室陨卵?，畢竟破血之功居多?！?/p>

E－選擇素是誘導(dǎo)性粘附分子，TNF－α、IL－1或LPS均可刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成E－選擇素［5］，E－選擇素有介導(dǎo)活化的內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞粘附的作用。E－選擇素介導(dǎo)的粘附作用既不依賴于白細(xì)胞的活化，也不需要白細(xì)胞整合素的參與。內(nèi)皮細(xì)胞上E－選擇素可識(shí)別白細(xì)胞，介導(dǎo)活化，使白細(xì)胞穩(wěn)定地粘附于內(nèi)皮細(xì)胞，繼而遷移至血管外組織。Wang等［6］研究證實(shí)，E－選擇素mRNA在缺血側(cè)腦組織微血管的表達(dá)6h才開(kāi)始出現(xiàn)，12h達(dá)高峰，可持續(xù)3～5天。E－選擇素主要在直徑為7.5～30μm的毛細(xì)血管前動(dòng)脈和毛細(xì)血管后靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。在缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，給予心腦通絡(luò)液和步長(zhǎng)腦心通后，各治療組腦組織E－選擇素mRNA的表達(dá)均有不同程度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，以高劑量組降低最為顯著，低劑量組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);高劑量組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明心腦通絡(luò)液可降低腦組織E－選擇素mRNA的表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄水平降低腦組織E－選擇素mRNA的表達(dá)，減輕炎性細(xì)胞的聚集、浸潤(rùn)，減輕炎癥和免疫反應(yīng)，有效減輕局灶性腦梗死引起的缺血性損傷。

［1］ 吳限，陳鵬.心腦通絡(luò)液對(duì)腦梗塞大鼠腦組織凋亡基因Bcl－2、p53 的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28(4):64－65.

［2］ Zea － Longa E，Weinstein PR，Carlson，et al.Reversible middle artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84 －91.

［3］ 朱慧淵.運(yùn)用“治未病”理論防治腦中風(fēng)探析［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(6):6 －8.

［4］ 鈔建峰，賈慧，孫風(fēng)平.試述以“虛”為核心的中風(fēng)病機(jī)觀［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(2):67 －68.

［5］ WillamG.Leukocyte responses to injury［J］.Arch Surg，2003，128(11):1260－1267.

［6］ Wang X，F(xiàn)euerstein GZ.Induced expression of adhesion molecules following focal brain ischemia［J］.J Neurotrauma，1995，12:825 －829.