崔瑾，王耀獻，孫衛(wèi)衛(wèi)，劉尚建，沈存，呂杰，王曉楠

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟病發(fā)展到終末期腎病的共同途徑。它以過量細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)積聚及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生為特征。腎小管間質(zhì)受損時，小管細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞，隨著病變的加重，繼而轉(zhuǎn)變表型為肌成纖維細(xì)胞，并以α－SMA表達為特征［1］。因此，α－SMA是衡量腎小管間質(zhì)纖維化的重要指標(biāo)。

和解聚散方是王耀獻教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)得出，從已經(jīng)完成的動物實驗和臨床觀察的結(jié)果證實，和解聚散方能夠改善腎功能，延緩終末期腎臟病進程［2－4］?；谝陨侠碚摷扒捌谘芯拷Y(jié)果，本文擬重點探討和解聚散方抗腎纖維化的作用機制是否與抑制大鼠腎組織α－SMA的表達有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性SD大鼠120只(體質(zhì)量180～220g，購自維通利華實驗動物公司)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為4組:I組假手術(shù)組，II組模型組，III組洛丁新組，IV組和解聚散方組，各30只，供給清潔大鼠飼料，自由飲水、進食，每籠5只，保持籠內(nèi)清潔。

1.2 試驗藥物 和解聚散方由黃芪、當(dāng)歸、海藻、牡蠣、穿山甲等藥物組成，來源于東直門醫(yī)院中草藥藥房，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制成煎劑，濃縮后高溫消毒封裝備用，濃度為每毫升含生藥1g。洛丁新(鹽酸苯那普利)購自北京諾華制藥有限公司。

1.3 造模及給藥方法 采用右側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)制備UUO模型，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組以5%的水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉后局部剃毛，常規(guī)消毒鋪孔巾，選擇背部正中線肋脊角旁開1cm切口，依次切開皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，將右側(cè)輸尿管結(jié)扎，然后連續(xù)縫合皮膚。假手術(shù)組手術(shù)入路方式同模型組，進入腹腔后分離右輸尿管但不結(jié)扎輸尿管。造模術(shù)后24h開始分別灌胃，Ⅰ、Ⅱ組灌胃生理鹽水(3ml/只)，Ⅲ組灌胃洛丁新(1.0mg/kg/d)，IV 組灌胃和解聚散方(9.8g/kg/d)。每組10只大鼠分別于造模術(shù)后第7、14、21天處死，留取梗阻側(cè)腎組織備用。

1.4 試劑 α－SMA小鼠來源單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色試劑盒 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兩步法免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 腎組織病理檢查 取梗阻側(cè)腎組織，以4%多聚甲醛固定后，脫水、浸蠟、石蠟包埋，切成3μm厚度的石蠟切片，分別行HE染色及Masson染色，光鏡下觀察腎臟皮質(zhì)區(qū)及皮髓交界區(qū)腎小管、腎間質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。

1.5.2 免疫組化檢測 使用兩步法免疫組化試劑盒，操作步驟按試劑盒說明進行，PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，采用光學(xué)顯微鏡(400×)觀察皮質(zhì)腎小管間質(zhì)區(qū)α－SMA的表達，以光鏡下細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。半定量分析采用Image Pro plus 6.0多媒體彩色病理圖像分析軟件。光鏡下在皮質(zhì)區(qū)選取10個不重疊視野，盡量避開腎小球和血管，計算陽性表達面積占總面積的百分比。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13.0計算機軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料的比較采用單因素方差分析，P＜0.05視為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)改變 HE、Masson染色觀察可知，假手術(shù)組腎間質(zhì)無纖維化;模型組出現(xiàn)腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫，且伴有不同程度的腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性及腎小管灶狀萎縮，小管管腔閉塞和/或擴張，部分腎小管腔內(nèi)有蛋白或細(xì)胞管型，間質(zhì)纖維化;洛丁新組、和解聚散方組病理變化較模型組減輕。

2.2 免疫組織化學(xué)和半定量分析 假手術(shù)組中α－SMA只在腎組織血管壁上表達;模型組、洛丁新組、和解聚散方組除血管壁上有表達外，可見大量陽性表達出現(xiàn)在腎間質(zhì)細(xì)胞胞漿中，同時部分小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)也出現(xiàn)陽性染色顆粒。半定量分析顯示，模型組、洛丁新組、和解聚散方組中α－SMA在術(shù)后7天、14天、21天表達均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)，兩個治療組的表達水平明顯低于模型組(P＜0.05)，和解聚散方組14天與洛丁新組14天比較有顯著性差異(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)α－SMA表達的比較(±s)

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)α－SMA表達的比較(±s)

注:與假手術(shù)比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05;與洛丁新組比較，△P＜0.05;與同組第7天比較，★P＜0.05;與同組第14天比較，▲P ＜0.05。

組別 時間(天) α－SMA陽性表達面積(%)0.039 7 ±0.024 85模型組 7 5.890 9 ±2.051 74*14 7.380 9 ±2.256 39*21 10.684 8 ±3.390 23＊★▲洛丁新組 7 2.419 7 ±0.731 51*#14 4.843 0 ±3.042 69＊★21 3.660 8 ±1.359 94*和解聚散方組 7 1.856 1 ±1.305 75*#14 1.940 8 ±0.882 11*#△21 2.204 4 ±0.317 02*#假手術(shù)

3 討論

UUO模型是目前公認(rèn)的較為成熟的一種研究腎小管間質(zhì)纖維化的實驗動物模型。輸尿管結(jié)扎后隨著病變進展，間質(zhì)纖維化形成，最終導(dǎo)致整個腎臟彌漫性損害，在本實驗中亦得到證實。

α－SMA作為一種細(xì)胞骨架蛋白，廣泛分布于平滑肌、肌上皮細(xì)胞、周細(xì)胞和一些基底細(xì)胞中，正常腎臟中僅有血管平滑肌細(xì)胞強陽性表達α－SMA，其它細(xì)胞通常不表達α－SMA。在腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中肌成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，并在ECM過度沉積，該細(xì)胞主要表達α－SMA，α－SMA是肌成纖維細(xì)胞激活的特異性標(biāo)志物。

腎組織α－SMA表達增高，表明腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞這些腎臟固有細(xì)胞被激活和異常增殖，具有肌成纖維細(xì)胞特性，合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)增多，參與腎臟的纖維化。即這些細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，由靜止表型轉(zhuǎn)化為增殖表型或分泌表型。

腎纖維化的中醫(yī)病機是“腎絡(luò)微型癥瘕”形成，消癥散結(jié)在腎纖維化的治療中具有重要意義。王耀獻教授創(chuàng)立和解聚散方，并以此加減治療慢性腎臟病，在臨床中取得了較好療效。和解聚散方由黃芪、當(dāng)歸、海藻、牡蠣、穿山甲等藥物組成，方中以黃芪、當(dāng)歸為君，補血活血，補氣扶正;穿山甲，海藻，牡蠣為臣，消癥散結(jié)，諸藥共奏和解聚散，扶正通絡(luò)之功。全方虛實并調(diào)，標(biāo)本兼顧，為治療腎纖維化的有效方劑?，F(xiàn)代藥理研究證實，黃芪能清除氧自由基，通過抑制TGF－β產(chǎn)生，減少ECM生成，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫及體液免疫，降低尿蛋白，保護腎功能［5－6］。黃芪當(dāng)歸合劑可明顯抑制大鼠腎小球內(nèi)和腎小管間質(zhì)部位α－平滑肌肌動蛋白的表達，下調(diào)JNK信號通路活化，從而抑制腎小球MsC表型轉(zhuǎn)化［7－8］。

本實驗結(jié)果表明，和解聚散方能夠降低UUO大鼠腎組織中α－SMA的產(chǎn)生，減緩腎纖維化的發(fā)展。充分說明了和解聚散方具有良好的抗腎纖維化作用，抑制腎臟固有細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及α－SMA的表達是其抗腎纖維化的機制之一，也說明了本方是一種防治延緩慢性腎臟病進展的有效中成藥物，有必要進行深入研究和臨床推廣應(yīng)用。

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