白云，李洋，章艷

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦血管病是一種以“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高”為特點的嚴重威脅人類，尤其是中老年人健康的常見病、多發(fā)病。據(jù)近年流行病學(xué)調(diào)查表明，我國每年死于腦血管病大約100萬人，其中缺血性腦血管疾病占60%～80%。因此，缺血性腦血管疾病日益受到醫(yī)藥學(xué)界的重視［1］。目前普遍認為，腦缺血是由多種作用機制共同作用的結(jié)果，中藥以其多成分、多靶點的特點在腦缺血的防治中具有獨特優(yōu)勢［2］?；钛L(fēng)方是以祛風(fēng)活血中醫(yī)理論指導(dǎo)下提出的新組方。本文旨在通過觀察活血熄風(fēng)方對MCAO模型大鼠腦皮質(zhì)cfos蛋白表達的影響，探討其神經(jīng)保護作用機制，并為研發(fā)作用機制明確的防治腦缺血中藥新藥奠定實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料

Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(300±20)g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供?；钛L(fēng)方(按常規(guī)方法制成水煎液，4℃保存?zhèn)溆?［3］;銀杏葉片(唐山榮大藥業(yè)有限公司);尼莫地平片(西安博愛制藥有限公司);PV6001二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋);c－fos抗體(美國SANTA Cruz公司);Q500IW圖像分析儀(德國Leica);光學(xué)顯微鏡(Olympus Japan BH －2)。

2 實驗方法

Wistar大鼠隨機分成7組，為活血熄風(fēng)方高劑量組(活血熄風(fēng)方10g/kg)、中劑量組(活血熄風(fēng)方5g/kg)、低劑量組(活血熄風(fēng)方2.5g/kg)、尼莫地平組(尼莫地平片21.6mg/kg)、銀杏葉片組(銀杏葉片135mg/kg)、模型對照組和假手術(shù)組(蒸餾水2ml/只)。各組均灌胃給藥7天，末次給藥后30min采用 Longa［4］方法，制備大鼠MCAO模型。待大鼠意識恢復(fù)后30min后，對其進行神經(jīng)功能缺損評分，評分在1～3分者納入研究。行為學(xué)評分后，各組大鼠以10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉，隨后開胸剪開右心耳，從左心室插管至升主動脈，迅速灌注約150ml肝素化生理鹽水，隨后緩慢灌注0.1mol/L磷酸緩沖液200ml(含4%多聚甲醛)。用剪刀從枕骨大孔剪開，完整取大腦，制作病理組織片，并按照常規(guī)免疫組化法檢測各組大鼠腦皮質(zhì)c－fos蛋白的表達。在缺血周邊區(qū)腦皮質(zhì)選擇5個非重疊視場，于100倍光鏡下計數(shù)陽性染色細胞數(shù)。實驗結(jié)果采用SPSS 11.5 for Windows統(tǒng)計軟件分析處理，采用Test檢驗。

3 實驗結(jié)果

免疫組化法檢測活血熄風(fēng)方對模型大鼠腦皮質(zhì)c－fos蛋白表達的影響，實驗結(jié)果見表1。

表1結(jié)果顯示，在24h、48h和72h不同時間點，模型對照組與假手術(shù)組比較，c－fos蛋白表達均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。在24h和48h時間點，活血熄風(fēng)方高、中劑量組、尼莫地平組、銀杏葉片組分別與模型對照組比較，c－fos蛋白表達均有不同程度的降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在72h時間點，活血熄風(fēng)方高劑量組、尼莫地平組與模型對照組比較，c－fos蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 活血熄風(fēng)方對模型大鼠腦皮質(zhì)c－fos蛋白表達的影響(n=10，±s)

表1 活血熄風(fēng)方對模型大鼠腦皮質(zhì)c－fos蛋白表達的影響(n=10，±s)

注:各組與模型對照組比較，*P＜0.05;模型對照組與假手術(shù)組比較，▲P＜0.01。

組別 劑量(mg/kg)個非重疊視場24h 48h 72h活血熄風(fēng)方高劑量組 10 18.31 ±3.26* 8.88 ±1.25* 5.92 ±1.34陽性細胞表達數(shù)(個)/5*活血熄風(fēng)方中劑量組 5 16.18 ±3.41* 9.89 ±1.87* 6.95 ±1.03活血熄風(fēng)方低劑量組 2.5 20.34 ±5.15 11.69 ±2.85 7.05 ±3.75銀杏葉片組 135 16.15 ±3.21* 8.23 ±1.16* 7.95 ±1.21尼莫地平組 21.6 14.27 ±3.44* 7.23 ±1.69* 5.12 ±0.39*模型對照組 － 22.10±3.39▲ 12.80±2.50▲ 8.38±2.41▲假手術(shù)組4.43 ±0.89 3.82 ±0.86 4.12 ±0.84－

4 討論

腦血管疾病是一種嚴重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病。近年來，對缺血性腦損傷發(fā)生的病理生理機制研究正在不斷深入。目前認為，缺血性腦損傷的發(fā)生是由炎癥反應(yīng)、自由基損傷、酸中毒和細胞凋亡等多種病理生理機制引發(fā)的復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)過程，因此尋找一種安全有效且能夠阻斷或減弱缺血性腦損傷級聯(lián)反應(yīng)各個環(huán)節(jié)的神經(jīng)保護藥物，也成為各國學(xué)者研究的熱點。盡管西藥中神經(jīng)保護藥物種類繁多，但由于臨床療效有限和不可避免的毒副作用，限制了其臨床應(yīng)用。而中醫(yī)藥具有整體調(diào)節(jié)和多環(huán)節(jié)綜合治療的優(yōu)勢，在防治缺血性腦損傷研究中顯示了較好的療效?；钛L(fēng)方是中醫(yī)理論指導(dǎo)下提出的新組方，全方以活血化瘀為主，能降低血管的張力，減輕腦動脈壓力。

c－fos是即刻早期癌基因(immediate－early genes，IEGs)中研究最多的一種原癌基因，作為細胞核第三信使分子與c－fos蛋白結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性，參與包括缺血性腦損傷在內(nèi)的多種病理反應(yīng)過程［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，活血熄風(fēng)方在24h和48h時間點，活血熄風(fēng)方高、中劑量組能夠降低模型大鼠腦皮質(zhì)c－fos蛋白表達。在72h時間點，活血熄風(fēng)方高劑量組能降低模型大鼠腦皮質(zhì)c－fos蛋白表達。由此推測，活血熄風(fēng)方對缺血性腦損傷的保護作用可能與其降低模型大鼠腦皮質(zhì)c－fos蛋白表達有關(guān)。其確切作用尚需通過進一步實驗進行驗證。

［1］ 周鴻雁，毛海峰，王一蓉，等.腦缺血損傷的研究進展［J］.湖南文理學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，2005，17(2):72 －75.

［2］ 胡偉東，胡耀祖，黃小平.中藥有效成分對腦缺血再灌注損傷保護作用的研究進展［J］.實用心腦肺血管病雜志，2010，18(1):92－95.

［3］ 白云，顏培宇，梁穎.活血熄風(fēng)方對MCAO局灶性腦缺血模型大鼠腦皮質(zhì)ICAM－1蛋白表達的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(1):13－15.

［4］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Revesible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84 －91.

［5］ 王巖，黃久儀.c－fos原癌基因表達在腦缺血方面的研究進展［J］.上海醫(yī)學(xué)，2006，29(3):189 －191.