李 寧，許向陽，姜景彬，李景富

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，武漢 430064；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

番茄葉霉?。‵ulvia fulva（Cook）ciferri）是番茄保護地生產(chǎn)中的主要病害，它即影響番茄的產(chǎn)量又影響果實的品質(zhì)，造成經(jīng)濟損失[1]。目前，選育和推廣抗病品種是解決番茄葉霉病最為經(jīng)濟、有效和環(huán)保的途徑。但是防治番茄葉霉病是十分困難的，這主要是因為番茄葉霉病原菌生理小種分化十分迅速，育成含有新的Cf抗病基因的栽培品種后不久，就會分化出侵染該基因的新生理小種[2-5]。例如，目前國內(nèi)抗葉霉病育種中普遍應(yīng)用的抗源Cf-4基因已被侵染，侵染抗源Cf-9基因的生理小種在華北地區(qū)也被監(jiān)測出來[6]。因而利用最新的、較高抗性的Cf基因?qū)⑹俏覈~霉病抗病育種的重要目標(biāo)之一。已報道有多個抗葉霉病基因在番茄栽培種及野生種中被發(fā)現(xiàn)，它們能夠克服不同的葉霉病生理小種[2,7-9]，鑒定和應(yīng)用新的抗源成為番茄抗葉霉病育種及研究中的新工作。

番茄與葉霉病病原菌的互作遵循“基因?qū)颉睂W(xué)說[10]，開展番茄抗葉霉病育種工作要根據(jù)當(dāng)?shù)厝~霉病病原菌生理小種的分化情況，將抗病基因?qū)Σ煌硇》N的抗病性進行鑒定，以便合理應(yīng)用抗源。傳統(tǒng)的人工接種抗病性鑒定，不僅需要較長的時間和花費較多的人力物力，直接影響多抗性新材料及新品種的選育進程，而且還易受環(huán)境條件、接種技術(shù)等影響，從而導(dǎo)致鑒定結(jié)果不穩(wěn)定?？共∮N是一個長期策略，合理利用抗病種質(zhì)資源保持持久抗性十分重要。分子標(biāo)記技術(shù)為快速篩選抗病基因鑒定提供了一項有力手段。利用分子標(biāo)記技術(shù)對葉霉病抗病基因的研究已取得較大進展，Cf-4和Cf-9基因緊密連鎖位于染色體1短臂的Milky Way位點[11-12]；Cf-2和Cf-5基因緊密連鎖位于染色體6短臂[13-14]，Cf-6基因同樣位于染色體 6 短臂[15]；Cf-11[16-17]、Cf-12[18-19]和Cf-19[16,20]也分別被定位于染色體上。

Cf-10和Cf-16基因是北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心從國外引進的番茄葉霉病抗源材料，目前針對這兩個抗源的研究較少。為了更有效地利用Cf-10和Cf-16基因進行番茄抗葉霉病育種及其他理論研究，本研究利用我國東北三省分化的葉霉病病菌生理小種分別對Cf-10和Cf-16基因進行抗性鑒定、遺傳分析和分子標(biāo)記，以明確Cf-10和Cf-16基因的抗性并進行分子定位，從而為下一步開展Cf-10和Cf-16基因的分子標(biāo)記輔助育種和基因克隆奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄抗葉霉病親本材料08HN30（含Cf-10基因）、08HN34（含Cf-16基因）由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供；感病親本材料07880、07881及不含任何抗性基因（Cf-0基因）的感病對照材料Money Maker由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所提供。分別構(gòu)建07881×08HN30和07880×08HN34的F2代分離群體。

1.2 對不同生理小種的抗病性鑒定及抗性遺傳分析

東北三省葉霉病生理小種，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所收集、分離和鑒定[21]，共8個生理小種：1.2、1.2.3、1.2.3.4、1.2.4、1.3.4、2.3、1.3和 1.4，用于08HN30和08HN34的生理小種抗病性鑒定。同時選用東北三省優(yōu)勢生理小種1.2.3.4接種07881×08HN30和07880×08HN34組合的父母本、F1、F2代，進行抗性遺傳分析。

采用噴霧接種法進行接種，接種苗齡為4片真葉期，濃度為107孢子·mL-1。接種前保持濕度100%，溫度22～25℃，3 d使葉霉菌進行繁殖，相對濕度降至80%保持11 d，接種14 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.3 病情分級標(biāo)準(zhǔn)

單株分級標(biāo)準(zhǔn)：0級—無癥狀；1級—接種葉有直徑1 mm的白斑或壞死斑；3級—接種葉有直徑2～3 mm的黃化斑，葉背面有少量白色霉?fàn)钗铮?級—接種葉有直徑5～8 mm的黃化斑，葉背面有許多白色霉?fàn)钗铮?級—接種葉有直徑5～8 mm的黃化斑，葉背面有黑色霉?fàn)钗?，同時上部葉片也有黑色霉?fàn)钗铮?級—接種葉病斑上有大量孢子，上部葉片也有孢子形成[16-18]。其中發(fā)病級別為0級、1級、3級為抗病株，5級、7級、9級為感病株。群體分級標(biāo)準(zhǔn)：免疫—病情指數(shù)為0，無侵染；高抗—0＜病情指數(shù)≤11；抗病—11＜病情指數(shù)≤22；中抗—22＜病情指數(shù)≤33；感病—33＜病情指數(shù)≤55；高感—病情指數(shù)＞55[16-18]。

1.4 DNA的提取及抗感池的建立

基因組DNA的提取采用CTAB法[22]，1.0%瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性，生物光度計測定DNA濃度，調(diào)整各樣品DNA濃度均為50 ng·μL-1。參照Michelmore等建立的混合分組分析（Bulked segregant analysis，BAS）法[23]，從F2代作圖群體中隨機選取10株抗病植株和感病植株，各取等量的DNA混合，對在雙親間表現(xiàn)多態(tài)性的引物進行進一步的篩選。

1.5 SSR分析

共選用341對SSR引物序列用于篩選抗病基因的連鎖標(biāo)記，分別來自SOL Genomics Network（http://www.sgn.cornell.edu/index.pl）及文獻(xiàn)[24-25]。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括1 μL DNA，2.0 mmol·L-1dNTP 和20 mmol·L-1MgCl2各2.0 μL，各1.5 μL SSR上下游引物，10 UTaqDNA聚合酶0.2 μL，10×PCR buffer 2 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35～62℃（依據(jù)引物而定）退火1 min，72℃延伸2 min，共38個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。SSR擴增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上檢測，銀染顯色[26]，觀察檢測結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)分析及遺傳距離的計算

χ2測驗檢測F2代抗感分離比率。Mapmaker 3.0[27]軟件計算標(biāo)記與Cf-10、Cf-16基因的連鎖關(guān)系，Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離（cM）[28]，LOD的臨界值設(shè)為3.0。應(yīng)用Mapchart 2.1繪制遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性鑒定及遺傳分析

接種2006～2007年東北三省監(jiān)測分化的8個葉霉病病原菌生理小種，以感病材料Money Maker為對照，分別對番茄葉霉病抗性基因Cf-10和Cf-16進行抗病性鑒定。結(jié)果表明：08HN30對東北三省分化出的8個葉霉病病原菌生理小種均表現(xiàn)為抗病或免疫；08HN34對除生理小種2.3外的葉霉病病原菌生理小種均表現(xiàn)抗病。

選用生理小種1.2.3.4分別對07881×08HN30和07880×08HN34的父母本、F1和F2代進行苗期接種鑒定，結(jié)果顯示：兩個雜交群體的F1代均表現(xiàn)為抗?。籉2代發(fā)生抗感分離。統(tǒng)計F2代群體抗感分離比例后，經(jīng)χ2測驗，均符合3∶1的分離比率（07881×08HN30：χ2=0.0156，χ23∶1=3.84；07880×08HN34：χ2=0.1437，χ23∶1=3.84），表明兩份抗原材料08HN30和08HN34對生理小種1.2.3.4的抗性均由單個顯性基因控制。

表1 Cf-10和Cf-16抗病基因的抗性鑒定Table 1 Resistance identification of Cf-10 and Cf-16 gene by inoculation with C.fulvum

2.2 抗葉霉病基因Cf-10和Cf-16的SSR標(biāo)記

341對引物用于分析親本間的多態(tài)性，07881×08HN30組合初步篩選出56對引物在兩親本間表現(xiàn)出多態(tài)性差異，占全部引物的16%。

經(jīng)多次重復(fù)結(jié)果穩(wěn)定，利用初篩獲得的56對引物進一步在抗感池中進行復(fù)篩，篩選出18對差異明顯且穩(wěn)定的引物用于F2代單株的篩選。用Mapmaker/Exp 3.0軟件計算表明，引物L(fēng)Etaa001（Forward primer:TGTAAGAGTGTCTGCCTGCAC；Reverse primer:ATGGGTTCGGGTTAGCTCTT）和LEaat003（Forward primer:TGTAAGAGTGTCTGCCTGCAC；Reverse primer:ATGGGTTCGGGTTAGCTCTT）與Cf-10基因連鎖，遺傳距離分別為9.7和22.9 cM；帶型統(tǒng)計表明，LEtaa001和LEaat003標(biāo)記在08HN30與07881雜交獲得的F2代群體中均表現(xiàn)為1∶2∶1的分離比率（見圖1、2）。

圖1 引物L(fēng)Etaa001在07881×08HN30的F2分離群體中的部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results using primer LEtaa001 in partial individuals of F2population in cross 07881×08HN30

圖2 引物L(fēng)Eaat003在07881×08HN30的F2分離群體中的部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results using primer LEaat003 in partial individuals of F2population in cross 07881×08HN30

07880×08HN34組合初步篩選出67對引物在兩親本間表現(xiàn)出多態(tài)性差異，占全部引物的20%，經(jīng)多次重復(fù)結(jié)果穩(wěn)定；進一步在抗感池中進行復(fù)篩，篩出27對差異明顯且穩(wěn)定的引物用于F2代單株的篩選。用Mapmaker/Exp 3.0軟件計算表明，引物Tom144-145（Forward primer:CTGTTTACTTCAAGA AGGCTG；Reverse primer:ACTTTAACTTTATTATT GCGACG）與Cf-16基因連鎖，遺傳距離為10.4 cM。根據(jù)Suliman-Pollatschek等發(fā)表的SSR引物[24]，Tom144-145位于番茄染色體11，由此推斷08HN34所含的番茄葉霉病抗性基因Cf-16位于染色體11（見圖3）。

圖3 引物Tom144-145在07880×08HN34的F2分離群體中的部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results using primer Tom144-145 in partial individuals of F2population in cross 07880×08HN34

3 討論與結(jié)論

從20世紀(jì)30年代加拿大和美國就開始番茄葉霉病抗病育種研究，并從栽培番茄及野生番茄中篩選出多個抗源應(yīng)用于番茄抗病育種。國內(nèi)在20世紀(jì)80年代開始應(yīng)用抗源基因進行抗葉霉病育種，當(dāng)前國內(nèi)育成的抗葉霉病番茄品種應(yīng)用的是Cf-4和Cf-9基因，但從國內(nèi)各地區(qū)關(guān)于番茄葉霉病病原菌生理小種分化的監(jiān)測結(jié)果看，能夠侵染Cf-4基因的生理小種1.2.3.4是我國大部分地區(qū)的優(yōu)勢生理小種，Cf-4基因已經(jīng)喪失抗性；目前已經(jīng)開始發(fā)現(xiàn)侵染Cf-9基因的菌株1.2.3.4.9[6]。抗病育種是一個長期工作，因而提前對較高抗性、且尚未應(yīng)用的葉霉病抗病基因Cf-10和Cf-16進行研究，明確抗性基因?qū)θ~霉菌生理小種的抗性范圍，建立分子標(biāo)記輔助選擇體系，在時間上獲得主動權(quán)，為應(yīng)對新分化的致病性更強的番茄葉霉病生理小種做好準(zhǔn)備是十分重要的工作。

本試驗中，08HN30和08HN34均對東北三省分化出的生理小種表現(xiàn)出較強的抗性，對優(yōu)勢生理小種1.2.3.4的抗性表現(xiàn)為受核顯性單基因控制，可以應(yīng)用于當(dāng)前的抗病育種工作中且非常容易通過雜交的方法導(dǎo)入抗病基因。建立了與Cf-10連鎖的SSR標(biāo)記LEtaa001和LEaat003，遺傳距離分別為9.7和22.9 cM；與Cf-16連鎖的SSR標(biāo)記Tom144-145，將Cf-16基因定位于染色體11，這與Kanwar等通過經(jīng)典遺傳定位的結(jié)果相同[29]。對Cf-10和Cf-16基因的抗性鑒定和初步定位為進一步合理利用葉霉病抗性基因奠定了理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)，下一步的研究將根據(jù)染色體定位的結(jié)果，結(jié)合已發(fā)表的番茄遺傳圖譜和相關(guān)染色體測序信息，開發(fā)新的SSR對抗性基因進行精細(xì)定位，為圖位克隆相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。

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