劉永光，劉克鋒，孫向陽(yáng)

（1.北京林業(yè)大學(xué)水保學(xué)院，北京 100083；2.北京農(nóng)學(xué)院城鄉(xiāng)發(fā)展學(xué)院，北京 102206）

系統(tǒng)獲得性抗性（Systematic acquired resistance，SAR）是植物抵御病原菌侵染的最有效手段[1]，我們可以利用SAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵功能基因來(lái)啟動(dòng)植物自然防御系統(tǒng)，達(dá)到廣譜抗病的目的。NPR1基因在植物的SAR發(fā)生中起著重要的作用，通過(guò)NPR1基因的過(guò)量表達(dá)可以誘導(dǎo)植物SAR的起始，使植物產(chǎn)生對(duì)多種病原菌的廣譜抗病性[2]。TGA2轉(zhuǎn)錄因子能直接和NPR1及其他多個(gè)病程相關(guān)基因啟動(dòng)子結(jié)合，從而啟動(dòng)SAR下游抗病基因的表達(dá)，增強(qiáng)病程相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，特異的誘導(dǎo)植物產(chǎn)生SAR，從而啟動(dòng)植物的廣譜抗病[3-4]。

TGA轉(zhuǎn)錄因子因?yàn)槠湫蛄兄泻蠺GACG/as-1元件而得名。近年來(lái)，因其能夠識(shí)別和結(jié)合植物的SAR反應(yīng)的相關(guān)基因，促使SAR相關(guān)反應(yīng)的啟動(dòng)，關(guān)于該轉(zhuǎn)錄因子家族的研究逐步深入，在模式植物擬南芥中，TGA家族現(xiàn)在共分離出六個(gè)成員，TGA1到TGA6，主要與植物的抗逆性和衰老等生理過(guò)程有關(guān)[5-6]。病原菌、傷害和植物激素類(lèi)物質(zhì)等多種外界因素均能誘導(dǎo)TGA基因的表達(dá)[7]。TGA轉(zhuǎn)錄因子可以和植物的廣譜抗病基因NPR1的錨定重復(fù)序列相互作用。轉(zhuǎn)錄因子TGA2還能直接和NPR1下游的PR1基因啟動(dòng)子感應(yīng)SA的調(diào)節(jié)元件結(jié)合[8]。

轉(zhuǎn)錄因子TGA2還能直接和NPR1下游的PR1基因啟動(dòng)子感應(yīng)SA的調(diào)節(jié)元件結(jié)合[9]。TGA轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物抗病過(guò)程調(diào)節(jié)的原理總結(jié)如下[8-9]：

圖1 TGA轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物抗病基因的調(diào)節(jié)Fig.1 Regulation pattern of TGA factors on plant disease-resistance gene

在水稻中發(fā)現(xiàn)，TGA2轉(zhuǎn)錄因子可以與PR1基因上有的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，將誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)變成細(xì)胞反應(yīng)，從而啟動(dòng)SAR[10]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，TGA2、TGA5、TGA6對(duì)植物系統(tǒng)獲得性抗病性的啟動(dòng)非常重要[11]。當(dāng)對(duì)這三個(gè)基因分別進(jìn)行敲除的時(shí)候，擬南芥中可以誘導(dǎo)SAR的啟動(dòng)，增強(qiáng)抗病性；全部進(jìn)行敲除的情況下，不能夠啟動(dòng)SAR和增強(qiáng)抗病性。這說(shuō)明這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的功能存在重疊[12]。在煙草中也發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)TGA2轉(zhuǎn)錄因子可以有效的增加PR相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗病性；而煙草TGA2失活突變體在SA處理后，不能夠誘導(dǎo)SAR的啟動(dòng)，說(shuō)明TGA2轉(zhuǎn)錄因子在SAR中起正調(diào)控作用[13]。與此同時(shí)，在轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草中，通過(guò)過(guò)量表達(dá)TGA轉(zhuǎn)錄因子或者將其基因沉默和敲除，發(fā)現(xiàn)TGA2和TGA5也存在一定的負(fù)調(diào)控作用[14]；研究還發(fā)現(xiàn)，TGA轉(zhuǎn)錄因子家族中TGA2、TGA3和NPR1基因的錨定結(jié)合力最強(qiáng)，TGA5、TGA6相對(duì)較弱[15]；TGA2可以在植物的所有組織中表達(dá)，TGA1和TGA3主要在植物的由內(nèi)組織和合根中表達(dá)[16]。

總之，TGA2轉(zhuǎn)錄因子能直接和多個(gè)病程相關(guān)基因啟動(dòng)子結(jié)合感應(yīng)SA的調(diào)節(jié)元件結(jié)合，能夠增強(qiáng)病程相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，特異的誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗病性，從而達(dá)到廣譜抗病的目的[17]。

本文采用RT-PCR的方法從擬南芥基因組中克隆TGA2轉(zhuǎn)錄因子，并將其構(gòu)建入植物表達(dá)載體中，期望通過(guò)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)目標(biāo)植物的SAR反應(yīng)的啟動(dòng)，相當(dāng)于使目標(biāo)植物體內(nèi)保持一種高抗病的免疫水平，從而達(dá)到廣譜抗病的目的，得到廣譜抗病植株。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為本實(shí)驗(yàn)室所保存的擬南芥，反轉(zhuǎn)錄由TaKaRa公司的BcaBESTTM RNA PCR KitVer.1.1反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成，限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自大連TaKaRa有限公司，T載體為購(gòu)自Promega公司的pGEM-T Vector；引物由上海Sangon公司合成，測(cè)序由上海Sangon公司完成，T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，大腸桿菌菌株為DH5α。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上所提供的TGA2基因的全序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物。上游引物：5'T↓CTTAGACA TATGGCTGATACCAGTCCGAG 3'；下游引物：5'CC C↓GGGTCACTCTCTGGGTCGA 3'。在上下游引物的5'端分別加上了XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2.2 擬南芥基因組RNA的提取

采用Invitrigen公司的Trizol Reagent提取擬南芥總RNA，方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[18]和《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[19]改良。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增

以水代替植物RNA作為負(fù)對(duì)照，擬南芥總RNA為模板，選用TaKaRa公司的BcaBESTTM RNA PCR KitVer.1.1反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行mRNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增出目的基因。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃3 min；94℃30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 15 s（34個(gè)循環(huán)）；72℃10 min，4℃短期保存。

1.2.4TGA2基因的切膠回收及與T載體的連接

將目的條帶在紫外透射儀下切下，采用TaKaRa的膠回收試劑盒，按照操作步驟進(jìn)行膠回收，然后與pGEM-T載體連接。利用PCR產(chǎn)物在3'末端自動(dòng)加A及pGEM-T載體上多克隆位點(diǎn)處突出T的特點(diǎn)，在10 μL連接體系中加入以下成分：PCR回收產(chǎn)物3 μL，pGEM-T vector 1 μL，2×buffer 5 μL，T4DNA連接酶1 μL，總反應(yīng)體系為10 μL，4℃連接過(guò)夜。

1.2.5TGA2基因的測(cè)序

將連接好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有X-gal和IPTG的LB+Amp選擇抗性平板上篩選白色菌落。對(duì)重組子進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，選擇鑒定結(jié)果正確的送上海生工公司測(cè)序。

1.2.6TGA2基因表達(dá)載體的構(gòu)建

將TGA2基因與pGEM-T載體連接所得到的載體命名為pGEM-TGA2。將pGEM-TGA2載體和p35STnos載體分別進(jìn)行SmaⅠ/XbaⅠ雙酶切，回收含有TGA2的片斷和p35STnos載體片斷，用T4DNA連接酶連接得到目的載體p35ST-TGA2。

2 結(jié)果與分析

2.1 所提取的擬南芥RNA

從圖2中可以看出，通過(guò)TRIzol Reagent法所提取的擬南芥，28S、18S、5S三條帶都有，說(shuō)明RNA的完整性比較好；28S亮度雖然沒(méi)有達(dá)到18S亮度的2倍，但5S條帶并沒(méi)有明顯變亮，說(shuō)明RNA提取過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生降解，可作為模板用于擴(kuò)增TGA2基因。

圖2 所提取的擬南芥RNAFig.2 RNA of Arabidopsis thaliana

2.2 TGA2基因的RT-PCR擴(kuò)增

測(cè)序結(jié)果顯示所克隆基因全長(zhǎng)993 bp，用DNAman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果和NCBI上所公布的序列進(jìn)行比對(duì)可知：所克隆基因與NCBI上所公布的序列99.80%同源。所克隆基因在317和500 bp處出現(xiàn)了兩個(gè)堿基的置換。對(duì)序列進(jìn)行翻譯后發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)置換并沒(méi)有導(dǎo)致TGA2基因氨基酸序列的改變，屬于正常的密碼子的第三位堿基的擺動(dòng)。所克隆基因含有TGA2轉(zhuǎn)錄因子的起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，是完整的TGA2基因（見(jiàn)圖3）。

圖3 所克隆TGA2序列與NCBI上所公布序列的比對(duì)Fig.3 Blast between the amplification of TGA2 and the original sequence of NCBI

2.3 TGA2植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以EcoRⅠ/SacⅠ對(duì)pBI121酶切，回收T-nos片段，插入用同樣雙酶切的pCAMBIA3300中構(gòu)建中間載體p3300-Tnos；以HindⅢ/XbaⅠ酶切p3301-BI121，回收CaMV35S片段，插入用同樣酶切的p3300-Tnos中構(gòu)建中間載體p3300-35ST；質(zhì)粒pT-TGA2用XbaⅠ/SmaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，回收含有TGA2基因的1.0 kb的目標(biāo)片段，插入以同樣酶切處理的p3300-35ST中，篩選陽(yáng)性克隆即得植物表達(dá)載體p35ST-TGA2（見(jiàn)圖4）。

圖4 p35ST－TGA2植物表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程Fig.4 Construction of p35ST-TGA2 plant expression vector

圖5 TGA2基因的反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增Fig.5 RT-PCR amplification results of TGA2 gene

2.4 TGA2基因植物表達(dá)載體的PCR及酶切檢測(cè)

TGA2基因植物表達(dá)載體的PCR及酶切檢測(cè)具體結(jié)果見(jiàn)圖5、6。

由圖5可以看出，以p35ST-TGA2質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到TGA2目的條帶。

由圖6可以看出，將所構(gòu)建的p35ST-TGA2載體用XbaⅠ單酶切，得到一條帶，而且大小正確。

將載體和基因內(nèi)部都含有的HindⅢ單酶切，得到兩條帶，大小正確；將載體用XbaⅠ/SmaⅠ雙酶切，得到兩條帶，大小正確。

以上檢測(cè)證明，所得到的目的載體構(gòu)建正確。

圖6 載體酶切鑒定Fig.6 Enzyme digestion results of plant expression vector p35ST-TGA2.Ⅵ

3 討論

植物抗病育種中缺乏可以直接利用的抗源，常規(guī)育種很難得到抗病品種。利用基因工程技術(shù)為植物抗病育種提供了新的途徑，但在以往的工作中，大部分的研究者將注意力集中于那些有直接抗菌活性的物質(zhì)，例如幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶，它們盡管在體外有抑菌活性，并且也獲得了一些轉(zhuǎn)基因抗病性提高的植株，但是很難達(dá)到高抗水平。

一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個(gè)與同類(lèi)性狀有關(guān)的基因的表達(dá)，在提高作物對(duì)環(huán)境脅迫抗性的分子育種中，與導(dǎo)入或者改良個(gè)別功能基因來(lái)提高某種抗性的傳統(tǒng)方法相比，從改良或者增強(qiáng)一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控能力著手，也許是提高作物抗逆性的更為有效的方法和途徑，增強(qiáng)一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的作用，就可以通過(guò)它促使多個(gè)基因發(fā)揮作用，從而是植株性狀獲得綜合改良的效果[20]。

對(duì)于廣譜抗病基因工程，盡管沒(méi)有明確的概念提出，但是目前越來(lái)越多的研究者注意到改造植物本身的防御水平和對(duì)病原菌的敏感程度可以達(dá)到提高植物抗病性的目的[21]。生產(chǎn)上向作物直接噴施水楊酸來(lái)防治病害就是一個(gè)明證。利用基因工程技術(shù)改造植物SAR發(fā)生進(jìn)程也取得了許多有益的進(jìn)展，例如，過(guò)量表達(dá)NPR1基因的擬南芥和轉(zhuǎn)基因高含量SA的煙草都表現(xiàn)出了不同程度的廣譜抗病結(jié)果[22]。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)車(chē)代弟教授將NPR1基因成功轉(zhuǎn)入唐菖蒲和百合中，并獲得轉(zhuǎn)基因植株，但后續(xù)的轉(zhuǎn)基因植株的田間試驗(yàn)未見(jiàn)報(bào)道[23-24]。

與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)很多科研工作者注意到TGA轉(zhuǎn)錄因子家族在SAR中所起到的重要作用，多篇文獻(xiàn)綜述都予以大量關(guān)注，相信國(guó)內(nèi)的植物廣譜抗病育種將會(huì)逐步開(kāi)展該基因的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用工作。

4 結(jié)論

本文在國(guó)內(nèi)首次將克隆到的擬南芥TGA2轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建植物表達(dá)載體，以期轉(zhuǎn)入植物獲得廣譜抗病植株。

*孫向陽(yáng)為本文的同等貢獻(xiàn)者。

[1] Oliver M J,Wood A J.Desiccation tolerance of mosses,in stress-inducible processes in higher eukaryotic cells[M].New York:Plenum Publishing Corp,1997:1-26.

[2] Zhang H Z,Cai X Z.Nonexpressor of pathogenesis related genes 1(NPRl):A key node of plant disease resistance signaling[J].Journal Biotechnology,2005,21(4):511-515.

[3] Cao H,Bowling S A,Gordon A S,et al.Characterization of anArabidopsis thalianasismutant that is non responsive to inducers of systemic acquired resistance[J].Plant Cell,1994(6):1583-1592.

[4] Cao H,Glazebrook J,Clarke J D,et al.TheArabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats[J].Cell,1997,88:57-63.

[5] Dong X.Generation of broad-spectrum disease resistance by over expression of an essential regulatory gene in systemic acquired resistance[J].Pro Nat Acad Sci USA,1998,95:6531-6536.

[6] Eulgem T,Somssich I E.Networks of WRKY transcription factors in defense signaling[J].Plant Biol,2007,10:366-371.

[7] Zhou J M,Trifa Y,Silva H,et al.NPR1 differentially interacts with members of the TGA/OBF family of transcription factors that bind an element of thePR-1 gene required for induction by salicylic acid[J].Mol Plant Microbe Interact,2000,13:191-202.

[8] Yu D Q,Chen C H,Chen Z X,et al.Evidence for an important role of WRKY DNA binding proteins in the regulation ofNPR1 gene expression[J].Plant Cell,2001,13:1527-1540.

[9] Zhang Y,Cheng Y T,Negative regulation of defense responses in Arabidopsis by two NPR1 paralogs[J]Plant J,2006,48:647-656.

[10] Cao H,Li X,Dong X.Generation of broad-spec-trum disease resistance by overexpression of an essential regulatory gene in systemic acquired resistance[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,95:6531-6536.

[11] Xu X,Chen C,Physical and functional interactions between pathogen-inducedArabidopsisWRKY18,WRKY40,and WRKY60 transcription factors[J].Plant Cell,2006,18:1310-1326.

[12] Sebastian.TheArabidopsisPR-1 promoter contains multiple integration stes for the coactivator NPR1 and the repressor SNI1[J].Plant Physiology,2010,15(44):5-18.

[13] Blanco F,Salinas P.Early genomic responses to salicylic acid inArabidopsis[J].Plant Mol Biol,2009,70:79-102.

[14] Boyle P,Le Su E.The BTB/POZ domain of theArabidopsisdisease resistance protein NPR1 interacts with the repression domain of TGA2 to negate its function[J]Plant Cell,2009,21:3700-3713.

[15] Durrant W,Wang S,Dong X.Rabidopsis SNI1 and RAD51D regulate both gene transcription and DNA recombination during the defenseresponse[J].ProcNatlAcadSciUSA,2007,104:4223-4227.

[16] Despres C,DeLong C,Glaze S R,et al.TheArabidopsisNPR1/NIM1 protein enhances the DNA binding activity of a subgroup of the TGA family of bZIP transcription factors[J].The Plant Cell,2005(12):279-290.

[17] Tada Y,Spoel S H.Plant immunity requires conformational changes of NPR1 via S-nitrosylation and thioredoxins[J].Science,2008,321:952-956.

[18] 莎姆布魯克J.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂,譯.北京:科學(xué)出版社,2005.

[19] 張維銘.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2007.

[20] Ekengren S K,Liu Y,Schiff M,et al.Two MAPK cascades,NPRI,and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato[J].Plant,2003,36:905-917.

[21] Kesarwani M,Yoo J,Dong X,Genetic interactions of TGA transcription factors in the regulation of pathogenesis-related genes and disease resistance inArabidopsis[J].Plant Physio,2007,144:336-346.

[22] Yoo S D,Cho Y H,Sheen J.Arabidopsismesophyll protoplasts:A versatile cell system for transient gene expression analysis[J].Nat Protoc,2006(2):1565-1572.

[23] 劉永光,車(chē)代弟,王金剛,等.RT-PCR法克隆擬南芥中NPR1基因及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,38(4):491-494.

[24] 王凱,車(chē)代弟,王金剛,等.百合遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(5):39-43.