汪財生，王 璐，劉麗平，李彩燕，錢國英 ，楊義右

(浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江寧波315100)

羊棲菜(Sargassum fusiforme)屬于褐藻門馬尾藻科，在我國廣東、福建、浙江等地海域均有分布，其中含有多種抗腫瘤和改善人體免疫的活性成分，對高血壓、大腸癌等均有一定療效，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值［1-2］。巖藻黃質(zhì)(fucoxanthin)又稱巖藻黃素、褐藻黃素，具有共軛雙鍵，且含有丙二烯和環(huán)氧烷結(jié)構(gòu)，屬類胡蘿卜素類色素［3］，廣泛存在于各種藻類、海洋浮游植物、水生貝殼類等動植物中［4-5］。國外曾報道巖藻黃質(zhì)可以抑制視黃醇缺陷引起的氧化壓力，且其抑制效果強于β-胡蘿卜素［6］。因此，羊棲菜中提取的巖藻黃質(zhì)類色素產(chǎn)品可能具有清除自由基及抗氧化等功能活性。本文從還原力、抗脂質(zhì)過氧化功能進行評價，并在清除DPPH·基礎(chǔ)上，采用熒光化學發(fā)光法進一步研究羊棲菜巖藻黃質(zhì)類色素粗品對活性氧自由基的清除能力，為其深度研究及開發(fā)應(yīng)用提供新的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

羊棲菜 購于浙江溫州洞頭縣，5～6 月新鮮藻體，清水沖洗藻體表面泥沙、鹽粒，瀝干后于-20℃冰柜中儲藏，實驗前取冰凍藻體真空冷凍干燥，粉碎過60 目篩于-20℃冰箱中避光密封保存?zhèn)溆?巖藻黃質(zhì)標準品 Sigma，≥99%;H2O2上海哈勃，≥30%;魯米諾 南京探求，≥98%;BHT 德國拜耳，99.8%;VC、VESigma，≥98%;DPPH Sigma，≥95%。

SFE-2 超臨界CO2萃取儀 美國ASI;ALPHA1-4/2-4LSC 冷凍干燥機 德國Christ;Cary50 紫外分光光度計 美國Varian;BC-027-TY6876 化學發(fā)光檢測儀 美國Beckman。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊棲菜巖藻黃質(zhì)類色素粗品的制備 稱取一定質(zhì)量的羊棲菜干粉，參考Myong-Kyun Roh 等［7］報道的超臨界CO2提取裙帶菜中巖藻黃質(zhì)方法改進，于提取壓力30MPa、溫度50℃的條件下超臨界CO2萃取1.5h，冷凍干燥得紅褐色巖藻黃質(zhì)粗品固體粉末，置于紅棕色樣品瓶-18℃保存?zhèn)溆?。參考尹尚軍等?］的方法，HPLC 測定色素干粉中巖藻黃質(zhì)含量7.36%。

1.2.2 還原力的測定 參考張福娣報道的方法［9］并略作調(diào)整，取一定濃度的待測液0.5mL，加0.2mol/L、pH6.6 的磷酸鹽(PBS)緩沖液和1% 的K3Fe(CN)6溶液各1.25mL，混勻，將混合液50℃保溫20min 后，加10%的三氯乙酸溶液2.5mL，混勻，1500r/min 離心10min。取上清液2.5mL，加2.5mL 蒸餾水及0.1%的FeCl31mL，混勻，10min 后檢測OD700nm值。實驗分別配制不同濃度的100、200、400、800、1000μg/mL 巖藻黃質(zhì)粗品、VC、VE，進行還原能力評價。

1.2.3 DPPH 法測定清除自由基能力 參考文獻［10-11］，精確稱取40mg 的DPPH·，用無水乙醇溶解、定容至500mL，配成2 ×10-4mol/L 的DPPH·溶液，置于棕色瓶備用。取DPPH·溶液2mL 加入到2mL 一定濃度的待測液中，充分混勻。室溫靜置30min 后檢測OD517nm值。樣品DPPH·的清除率可由公式(1)計算。實驗分別配制不同濃度的100、200、400、800、1000μg/mL 巖藻黃質(zhì)粗品、VC、VE，進行DPPH 清除率評價。

式中，Ae=2mL DPPH·溶液+2mL 無水乙醇的OD517nm值;Ai=30min 反應(yīng)后2mL DPPH·溶液+2mL待測溶液的OD517nm值;Aj=30min 反應(yīng)后2mL 無水乙醇+2mL 待測溶液的OD517nm值。

1.2.4 羥自由基清除能力測定 實驗用魯米諾化學發(fā)光法測定Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生·OH 的清除能力，按文獻［12］方法，調(diào)整H2O2量，化學發(fā)光儀中快速啟動發(fā)光反應(yīng)，記錄每間隔2s 發(fā)光強度值，至出現(xiàn)峰值，共180s 積分峰值CP1，同時用甲醇做空白對照，其發(fā)光強度積分峰值記為CP0，則·OH 的清除率由公式(2)計算。實驗分別配制不同濃度的100、200、400、800、1000μg/mL 巖藻黃質(zhì)粗品、VC、VE，進行·OH清除率評價。

式中，CP0-甲醇的空白發(fā)光積分值;CP1-待測液的發(fā)光積分值。

1.2.5 超氧陰離子自由基清除能力測定 參考文獻［12］，以化學發(fā)光法分別測定100、200、400、800、1000μg/mL 不同濃度的巖藻黃質(zhì)粗品、VC、VE對非酶體系堿性連苯三酚產(chǎn)生的O-2·的清除能力。在反應(yīng)池中加50μL 的5mmol/L 的魯米諾溶液和不同濃度待測液50μL，充分混勻，再加100μL 的6mmol/L 的連苯三酚溶液，快速于發(fā)光儀中啟動反應(yīng)，每2s 測定一次發(fā)光強度，至出現(xiàn)峰值，積分值CP1。同時用甲醇作空白對照，其發(fā)光強度積分值記作CP0，則O2-·的清除率由公式(3)計算:

式中，CP0-甲醇的空白發(fā)光積分值;CP1-待測液的發(fā)光積分值。

1.2.6 過氧化氫清除能力的測定 參考呂曉玲等［12］報道的方法，用魯米諾化學發(fā)光法，在反應(yīng)池中加50μL 待測液，1mol/L 魯米諾溶液50μL，pH9.5 的碳酸緩沖液100μL，充分搖勻后，加體積分數(shù)0.15%的H2O2溶液50μL，開啟反應(yīng)，每2s 測定一次發(fā)光強度，至出現(xiàn)峰值，積分值CP1，以甲醇作為空白對照，其發(fā)光強度積分值記作CP0，則H2O2的清除率由公式(4)計算。實驗分別配制不同濃度的100、200、400、800、1000 μg/mL 巖藻黃質(zhì)粗品、VC、VE，進行H2O2清除率評價。

式中，CP0-甲醇的空白發(fā)光積分值;CP1-待測液的發(fā)光積分值。

1.2.7 抗脂質(zhì)過氧化功能的測定 參考鄧勝國等［11］報道的方法略作調(diào)整，用亞油酸加速氧化法測定巖藻黃質(zhì)粗品的抗脂質(zhì)過氧化功能。將不同濃度的待測液0.2mL 分別加至具塞試管中，再加2.5%的亞油酸1mL 和0.05mol/L 的PBS 緩沖液(pH7)0.8mL，置于45℃恒溫培養(yǎng)箱中，空白對照用0.2mL 無水甲醇代替待測液。每隔24h 取45℃恒溫培養(yǎng)液0.05mL，加75%甲醇4.85mL 和30%硫氰酸銨0.05mL，再加3.5%HCl 配制的0.02mol/L 的FeCl2溶液0.05mL，反應(yīng)3min，用分光光度計測定OD500nm值，考察亞油酸過氧化物生成量。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)均采用Excel 進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊棲菜巖藻黃質(zhì)類色素粗品還原能力

還原性是一種物質(zhì)抗氧化能力的一個重要指標，也是物質(zhì)抗氧化機理之一。一般情況下樣品的還原能力與抗氧化活性之間呈顯著的相關(guān)性［13］，即反應(yīng)后吸光值的大小直接反映還原力強弱，吸光值越大，抗氧化活性越強。羊棲菜巖藻黃質(zhì)粗品與對照品VC、VE還原能力如圖1 所示，均表現(xiàn)為與樣品濃度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.991、0.986、0.998。VC、VE還原能力較強，隨樣品濃度增加而呈增強趨勢明顯，而巖藻黃質(zhì)粗品表現(xiàn)為最低，且增加樣品濃度還原能力增強緩慢。原因可能是還原體系的酸及溫度條件影響巖藻黃質(zhì)粗品的穩(wěn)定性，還原能力不明顯。

2.2 清除DPPH·能力

圖1 VC、VE、巖藻黃質(zhì)粗品的還原能力(sd)Fig.1 Reducing power of VC，VE and fucoxanthin

按照1.2.3 的方法測定巖藻黃質(zhì)粗品、VE、VC對DPPH·的清除率，結(jié)果如圖2 所示，在100～1000μg/mL實驗濃度范圍內(nèi)，巖藻黃質(zhì)粗品、VE、VC對DPPH·的清除率均隨著濃度的增加而增大，均呈良好的劑量-效應(yīng)的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.994、0.993、0.915。VEDPPH·的IC50為267.314μg/mL，清除效果最好。VC次之，為357.068μg/mL。而巖藻黃質(zhì)的DPPH·的IC50達到565.2μg/mL，為VE的211.4%;但濃度為1000μg/mL 時，巖藻黃質(zhì)的DPPH·清除率達到88.79%，與同濃度VC清除率(90.07%)相當，僅低于VE8.25%;當濃度為200μg/mL 時，DPPH·清除率為21.61%，略高于楊立群［14］通過硅膠柱層析獲得的海帶巖藻黃質(zhì)產(chǎn)品濃度為270μg/mL 時的19.85%。

圖2 巖藻黃質(zhì)粗品、VE、VC 的DPPH 自由基清除能力(xˉ±sd)Fig.2 Scavenging activities of fucoxanthin，VE and VC on DPPH·

2.3 清除·OH 能力

巖藻黃質(zhì)粗品、VC、VE對由Fenton 反應(yīng)體系產(chǎn)生·OH 的清除效果如圖3 所示，三個樣品在濃度為100～1000μg/mL 時，對·OH 清除的效果表現(xiàn)良好的量效關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.971、0.967、0.982。樣品對·OH 的IC50分別為386.29、650.28、253.35μg/mL，當受試濃度至1000μg/mL 時，其·OH 清除率分別為81.22%、65.33%、93.21%，表明該巖藻黃質(zhì)粗品清除·OH 作用僅次于VE，遠強于VC，具有較好地·OH清除效果。因此，選用天然巖藻黃質(zhì)粗品制成保健品等，具有防衰老、預(yù)防疾病的重要意義。

2.4 清除O2- ·能力

清除O2-·能力結(jié)果如圖4 所示。在濃度為100～1000μg/mL 范圍內(nèi)，巖藻黃質(zhì)粗品、VE、VC對由堿性連苯三酚體系產(chǎn)生的O2-·清除效果均隨其質(zhì)量濃度的增加而增強，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.900、0.959、0.960，具有良好的量效關(guān)系;各樣品O2-·清除率的IC50分別為615.71、469.45、355.27μg/mL，即對O2-·清除率作用大小是VC＞VE＞巖藻黃質(zhì)粗品。當濃度達1000μg/mL 時，巖藻黃質(zhì)粗品、VC、VE對O2-·的清除率相當接近，分別為83.98%、87.75%、85.54%，即巖藻黃質(zhì)粗品的O2-·的清除率略低于VC與VE。而嚴小軍等［15］采用硅膠柱層析純化獲得的鼠尾藻巖藻黃質(zhì)產(chǎn)品濃度為10μg/mL 時，O2-·清除率為7.9% ±0.4%，高于VE的6.9% ±2.6%。推測由于巖藻黃質(zhì)產(chǎn)品純度及不同藻類來源的區(qū)別所致。

圖3 巖藻黃質(zhì)粗品、VC、VE 的·OH 清除能力(sd)Fig.3 Scavenging activities of fucoxanthin，VC and VE on·OH

圖4 巖藻黃質(zhì)、VE、VC 的O -2 ·清除能力(sd)Fig.4 Scavenging activities of fucoxanthin，VE and VC on O -2 ·

2.5 H2O2 清除能力

按照1.2.6 方法測定巖藻黃質(zhì)粗品對H2O2的清除率，結(jié)果如圖5 所示。樣品在濃度為100～1000μg/mL范圍內(nèi)，也具有良好的量效關(guān)系，隨樣品濃度增加H2O2的清除率增強，巖藻黃質(zhì)粗品、VE、VC的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.898、0.955、0.921。巖藻黃質(zhì)粗品對H2O2的IC50為658.74μg/mL，清除能力小于VC、VE，但對H2O2清除作用在受試濃度范圍內(nèi)效果明顯，清除率由14.86%增大到71.51%。實驗表明巖藻黃質(zhì)粗品及標準對照品VC、VE都可作為H2O2清除劑。

圖5 巖藻黃質(zhì)、VC、VE 的H2O2 清除能力(sd)Fig.5 Scavenging activities of fucoxanthin，VC and Ve on H2O2

2.6 抗脂質(zhì)過氧化功能

如圖6 所示，亞油酸在45℃條件下保溫時，過氧化作用十分顯著，加入抗指質(zhì)氧化劑巖藻黃質(zhì)粗品、BHT、VC后，過氧化作用能明顯受到抑制，均隨著樣品濃度的增加，其抗脂質(zhì)過氧化作用增強，并在實驗期內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定。巖藻黃質(zhì)粗品受試各濃度及實驗期內(nèi)的吸光值均小于400μg/mL VC的吸光值，表明巖藻黃質(zhì)粗品的抗脂質(zhì)過氧化作用遠遠強于VC。但巖藻黃質(zhì)粗品總體對脂質(zhì)氧化的抑制約為BHT 的50%。實驗濃度范圍內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化功能的強弱順序依次為BHT、巖藻黃質(zhì)粗品、VC。實驗表明巖藻黃質(zhì)粗品具有較強的抗脂質(zhì)過氧化功能，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑。

圖6 巖藻黃質(zhì)、VC、BHT 對脂質(zhì)過氧化的抑制能力(sd)Fig.6 Restraint activities of fucoxanthin，VC and BHT on lipid peroxidation

3 結(jié)論

超臨界CO2提取的羊棲菜巖藻黃質(zhì)色素產(chǎn)品屬于天然類胡蘿卜素，體外抗氧化實驗表明，在被試濃度范圍內(nèi)的還原能力表現(xiàn)不強，但對DPPH·、·OH、O2-·等自由基及H2O2均表現(xiàn)出較強的清除能力，其中對·OH 的清除能力高于對照品VC，IC50為386.29ug/mL，遠低于VC的650.28ug/mL;對O2-·的清除能力與VC相當。此外，巖藻黃質(zhì)粗品的抗脂質(zhì)過氧化功能明顯強于VC。因此，羊棲菜中巖藻黃質(zhì)粗產(chǎn)品是一種具有良好抗氧化功能的天然食用色素，可用于食品的著色、防止許多由體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和自由基損傷引起的疾病，起到一定的保健作用。本研究使用的是羊棲菜巖藻黃質(zhì)色素粗品，成分比較復(fù)雜，主要包括巖藻黃質(zhì)、巖藻黃醇、脂類等物質(zhì)，可通過進一步純化提高羊棲菜巖藻黃質(zhì)純度，有望成為一種天然的新型高效抗氧化劑成分在食品、化妝品及保健品上得到開發(fā)利用。

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