陳華，徐紅，安磊，鮑旭，高萌，梅林，田燕#（1.大連兒童醫(yī)院藥劑科，遼寧大連116001；.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧大連 116044）

齊墩果酸（OA）是天然五環(huán)三萜類化合物，具有消炎、抗腫瘤和抗高血脂等多方面的藥理作用[1]，目前市售劑型主要有片劑、膠囊劑等。但是由于OA脂溶性較強，在胃腸道的溶出低、吸收差，導(dǎo)致其生物利用度低，不能被人體很好地吸收利用，故限制了其藥理作用的充分發(fā)揮。

納米粒（NPs）用作藥物載體具有粒度小、比表面積大、活性中心多、吸附能力強等優(yōu)點，經(jīng)靜脈注射后，在體內(nèi)的分布首先取決于微粒的粒徑大小。通常粒徑為50～100 nm的微粒系統(tǒng)可以進入肝實質(zhì)細胞中；粒徑為100～200 nm的微粒很快被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細胞從血液中清除，最終可到達肝枯否細胞（Kupffer cell）溶酶體中；同時表面帶負(fù)電荷的微粒易被肝臟攝取[2]。因此控制NPs的粒徑及表面帶電性，有望實現(xiàn)對肝臟的主動靶向作用。

本試驗采用水溶性四氮唑（WST-1）法比較大連醫(yī)科大學(xué)自制的3種OA-NPs，即OA/乳酸羥基乙酸共聚物納米粒（OAPLGA-NPs，簡稱OPN）[3]、OA/乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E納米粒（OA-PLGA-TPGS-NPs，簡稱OPTN）[4]和OA/聚己內(nèi)酯-聚乳酸-水溶性維生素E納米粒（OA-PCL-PLA-TPGS-NPs，簡稱OPPTN），對小鼠腹水型肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移細胞株（HCa-F）的體外抑制作用，為OA-NPs在體內(nèi)對肝臟的主動靶向性、體內(nèi)抑瘤率等試驗奠定基礎(chǔ)，以使OA能更好地發(fā)揮其保肝和抗肝癌等作用，并為制備OA新制劑提供試驗依據(jù)，使其具有更大的開發(fā)和應(yīng)用前景。

1 儀器與材料

1.1 儀器

354型酶標(biāo)儀（美國Thermo電子公司）；FA1104型萬分之一電子天平（上海精科實業(yè)有限公司）。

1.2 試藥

OPN（批號：20100908，規(guī)格：260mg·g－1）、OPTN（批號：20100908，規(guī)格：280mg·g－1）、OPPTN（批號：20100908，規(guī)格：270mg·g－1）、OA溶液劑（簡稱OS，溶媒：聚乙二醇400，批號：20100912，濃度：800μg·m L－1）均由大連醫(yī)科大學(xué)藥劑學(xué)教研室自制；氟尿嘧啶注射液（深圳三順制藥有限公司，批號：20110320，規(guī)格：25mg·m L－1）；WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（德國羅氏公司，批號：M1680）；DMEM培養(yǎng)基（上海億欣生物科技有限公司，批號：9008-97-3）；其余輔料均為藥用規(guī)格，所用試劑均為分析純。

1.3 細胞株

HCa-F，由大連醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)教研室提供，培養(yǎng)條件：pH 7.2的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2 方法[5]與結(jié)果

2.1 細胞傳代

常規(guī)方法復(fù)蘇HCa-F凍存細胞，鏡下計數(shù)活瘤細胞個數(shù)。調(diào)整活瘤細胞濃度為3×107個/m L。將0.2m L細胞懸液接種于小鼠腹腔，6 d后腹水完全形成，取腹水，將活瘤細胞濃度調(diào)整為2×107個/m L，為體外試驗做準(zhǔn)備。

2.2 細胞分組[5]

試驗分為8組，分別為陽性對照組：接種細胞后加入10μL氟尿嘧啶注射液（終濃度為2.5、10、20μg·m L－1）；OPN、OPTN、OPPTN組：接種細胞后分別加入10μL對應(yīng)的OPN、OPTN、OPPTN的混懸液（OA終濃度分別為2.5、10、20μg·m L－1）；OS組：接種細胞后加入10μL OS（OA終濃度分別為2.5、10、20 μg·m L－1）；空白NPs組：接種細胞后加入10μL空白NPs混懸液（不含OA，材料濃度同OS組）；陰性對照組：接種細胞后加入10μL培養(yǎng)液；空白組：不加任何物質(zhì)，直接將96孔板在酶標(biāo)IR＝[1－（A試驗組－A空白組）（/A陰性對照組－A空白組）]×100%。用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)采用±s表示，多組資料采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。測得空白組A＝0.046±0.011（n＝6），陰性對照組A＝0.063±0.013（n＝6），試驗組培養(yǎng)不同時間后對HCa-F細胞的IR及其方程（將同一培養(yǎng)時間的3個藥物濃度分別與對應(yīng)的IR進行線性回歸，得到不同培養(yǎng)時間的IR方程）見表1。儀上測定。每組6個復(fù)孔，除陰性對照組和空白組外其余各組為試驗組。

2.3 細胞生長抑制率（IR）

用含10%胎牛血清、100 u·m L－1青霉素、100μg·m L－1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液，以每孔5×103個細胞接種于96孔板，每孔100μL。按“2.2”項下分組分別加入相應(yīng)藥物，每孔10μL，在飽和濕度條件下，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入計算量的WST-1溶液10μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。選擇450 nm波長在酶標(biāo)儀上測定各孔的吸光度（A）值，參比波長為600 nm，記錄結(jié)果，分別計算其IR，

表1 試驗組培養(yǎng)不同時間后對HCa-F細胞的IR值及其方程（±s，n＝6）Tab 1 Absorbance and IR equation of HCa-F after different incubation duration（±s，n＝6）

表1 試驗組培養(yǎng)不同時間后對HCa-F細胞的IR值及其方程（±s，n＝6）Tab 1 Absorbance and IR equation of HCa-F after different incubation duration（±s，n＝6）

組別空白NPs組陽性對照組濃度/μg·mL－1 IR/%OPN組2.5 10 20 2.5 10 20 IR方程OPTN組2.5 10 20 IR方程OPPTN組2.5 10 20 IR方程OS組2.5 10 20 24h 2.2±0.3 29.3±0.8 47.5±0.9 57.6±1.4 21.7±0.9 28.9±0.7 39.6±0.9 IR=1.0254c+18.958（r=0.9991）35.8±1.1 57.6±1.2 68.7±1.3 IR=1.8384c+34.118（r=0.9299）32.9±1.0 51.6±1.1 60.7±1.2 IR=1.5519c+31.588（r=0.9241）12.9±0.6 17.6±0.7 23.8±0.9 48h 4.9±0.4 30.2±0.8 49.8±1.0 60.3±1.1 35.8±1.0 56.3±1.1 70.6±1.4 IR=1.9584c+33.018（r=0.9662）50.7±1.2 69.6±1.3 85.6±1.3 IR=1.9730c+47.259（r=0.9831）43.2±1.1 64.4±1.0 78.6±1.2 IR=1.8930c+39.559（r=0.9901）15.8±0.8 21.3±0.7 28.7±0.6 72h 6.2±0.6 31.5±0.9 50.3±0.8 60.6±0.9 42.9±0.9 63.6±1.1 75.4±1.3 IR=1.8443c+40.786（r=0.9479）54.3±1.2 79.2±1.4 92.6±1.5 IR=2.3211c+49.122（r=0.9991）50.8±0.8 71.7±1.3 83.9±1.2 IR=2.0876c+43.851（r=0.9657）16.7±0.8 22.5±1.0 29.4±0.9

由表1結(jié)果表明，（1）空白NPs組培養(yǎng)72 h時的IR＝（6.2±0.6）%，計算可知其中細胞的存活率為93.8%，表明空白NPs沒有明顯的細胞毒性。（2）與同組中相同時間2.5μg·m L－1比較，OPN、OPTN、OPPTN組OA濃度為20μg·m L－1時IR均明顯升高（P均＜0.01），表明隨OA濃度的增加，OPN、OPTN、OPPTN的體外抗腫瘤活性逐漸增強，即其抗腫瘤活性具有濃度依賴性。（3）與陽性對照組相同濃度比較，72 h時OPN、OPTN、OPPTN組OA濃度為10、20μg·m L－1時IR均明顯升高（P均＜0.01），OA濃度為2.5μg·m L－1時IR無明顯變化，表明OPN、OPTN和OPPTN具有良好的緩釋作用以及較高的體外抗腫瘤活性。（4）與陽性對照組相同濃度比較，OS組3個濃度培養(yǎng)24、48、72 h的IR均無明顯變化（P均＞0.05），表明OS組和陽性對照組中的藥物釋放快，在培養(yǎng)液中很快達到最大釋放量，而發(fā)揮其抗腫瘤的作用，故不同時間對HCa-F細胞的IR變化較小。（5）與同組中相同濃度24 h比較，OPN、OPTN、OPPTN組3個濃度培養(yǎng)72 h的IR均明顯升高（P均＜ 0.01），表明隨培養(yǎng)時間的延長，OPN、OPTN、OPPTN的體外抗腫瘤活性逐漸增強，即其抗腫瘤活性具有時間依賴性。

2.4 半數(shù)抑制濃度（IC50）

IC50是在指定時間內(nèi)培養(yǎng)的細胞被殺死一半時所需要的藥物濃度，是體外藥物制劑治療作用的定量評價方法。根據(jù)OPN、OPTN、OPPTN組的IR方程，將IR＝50%分別代入不同培養(yǎng)時間的IR方程，計算其IC50。不同濃度OPN、OPTN、OPPTN組培養(yǎng)不同時間后對HCa-F細胞的IC50比較見表2。

表2 不同濃度OPN、OPTN、OPPTN組培養(yǎng)不同時間后對HCa-F細胞的IC50比較（n＝6）Tab 2 Comparison of IC50 of OPN，OPTN and OPPTN at different concentrations to HCa-F after different incubation duration（n＝6）

由表2結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，3種OA-NPs對HCa-F細胞的IC50逐漸減小，其中OPTN組明顯小于OPPTN組和OPN組（P＜0.05或P＜0.01），主要是因為OPTN粒徑更小、表面所帶負(fù)電荷的絕對值更大[3，4]，更易被腫瘤細胞攝取、吞噬，以及藥物釋放更快更完全[2]。

3 討論

不同濃度OPN、OPTN和OPPTN組的IR在相同時間時分別明顯高于OS組（P均＜0.01），表明NPs作為藥物載體由于其粒徑、表面電荷等有助于OA被細胞更好地攝取、吞噬，使OA能更好地發(fā)揮其抗腫瘤作用；而3種OA-NPs均在72 h時的抗腫瘤作用最強，這是因為此時NPs釋放出藥物量最多，表明其良好的緩釋性和靶向性。

本試驗結(jié)果表明，HCa-F細胞體外培養(yǎng)24、48、72 h時3個濃度的OPTN、OPPTN組的IR均明顯比OPN組高，差異具有顯著性意義（P＜0.05或P＜0.01）。這是因為OPTN組和OPPTN組隨著其載體材料PLGA-TPGS、PCL-PLA-TPGS的降解能釋放出更多的TPGS，而TPGS能通過抑制P糖蛋白改善細胞膜的滲透性，增強藥物的吸收，有效地抑制癌細胞的增長[6]；將其與PLGA、PCL、PLA合成新的高分子材料后，不但能增強載體的水溶性，同時由于其所帶負(fù)電荷，更易被肝細胞攝取，還能加強載體對肝臟的主動靶向作用，能進一步增強OA的抗腫瘤活性。

本試驗采用WST-1法測定，是因為其作為MTT的升級替代產(chǎn)品，和MTT或其他MTT類似產(chǎn)品如XTT（二甲氧唑黃細胞增殖分析試劑盒）、MTS（3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑鹽細胞增殖與毒性檢測試劑盒）等相比有明顯的優(yōu)點。首先，WST-1被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的甲（Formazan）是水溶性的，不需要有特定的溶劑（如二甲基亞砜）來溶解，可以省去后續(xù)的溶解步驟；其次，WST-1產(chǎn)生的甲比XTT和MTS產(chǎn)生的甲更易溶解，可減少損失；再次，WST-1比XTT和MTS穩(wěn)定，也可使試驗結(jié)果更加穩(wěn)定，故線性范圍更寬、靈敏度更高。

本研究關(guān)于IC50的計算參考國外文獻[7]采用3個濃度，試驗結(jié)果存在一定的局限性，有待進一步證明。

綜上，3種OA-NPs具有良好的細胞相容性和抗腫瘤作用，IR均明顯高于OS組，其中OPTN組的最高，對OA應(yīng)用和臨床研究具有一定的參考價值。由于時間有限，本試驗僅用WST-1法研究OA-NPs在體外對腫瘤細胞的抑制作用，其對肝臟的主動靶向性、體內(nèi)藥效學(xué)評價等有待進一步的研究。

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