李天媛，鄒麗敏，陳建斌，李博，張偉（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院，南京10008；.中國(guó)藥科大學(xué)，南京 10009；.江蘇省生產(chǎn)力促進(jìn)中心，南京 1004）

器官移植為21世紀(jì)醫(yī)學(xué)發(fā)展的主要方向之一，是治療終末期器官衰竭唯一有效的根治手段。器官保存是器官移植學(xué)的基石，器官保存的根本目的是最大限度減少缺血對(duì)離體器官造成的各種損傷，使離體器官保持有效的活力，以便完成運(yùn)送、配型和手術(shù)，使移植器官在手術(shù)后迅速恢復(fù)功能[1]。器官保存液是器官保存研究中最為重要的問題之一，為了提高患者長(zhǎng)期存活率、緩解供器官短缺的矛盾，器官保存液必須能夠在一定的時(shí)間內(nèi)最大限度地降低離體器官的缺血性損傷。

再灌注損傷主要是氧自由基大量產(chǎn)生的結(jié)果，阻止自由基產(chǎn)生可以防止缺血/再灌注損傷[2]。別嘌呤醇是一種黃嘌呤氧化酶的特異性抑制劑，能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制黃嘌呤氧化酶，減少再灌注期氧自由基的產(chǎn)生。腺苷參與心肌能量代謝，同時(shí)還參與擴(kuò)張冠脈血管、增加血流量。因此，別嘌呤醇和腺苷兩者均為細(xì)胞保存液中的重要成分，是保持離體器官活性的重要物質(zhì)[3～5]。筆者據(jù)此自制了器官保存液，雖然其配比簡(jiǎn)單，但也可以達(dá)到維持細(xì)胞周圍內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的效果，前期試驗(yàn)表明低溫保存狀態(tài)下可保存16 h。為考察其質(zhì)量，筆者建立了可同時(shí)測(cè)定細(xì)胞保存液中別嘌呤醇和腺苷含量的高效液相色譜（HPLC）法，并對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10ATHPLC儀、SPD-10A紫外-可見光檢測(cè)器（日本島津公司）；智達(dá)N2000色譜工作站（浙江大學(xué)）。

1.2 試藥

腺苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110879-200202，純度：99.9%）；別嘌呤醇對(duì)照品（江蘇方強(qiáng)制藥廠，批號(hào)：20111023，純度：99.5%）；樣品：器官保存液（南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院，處方：腺苷1.5 g，別嘌呤醇0.15 g，混勻后，加水溶解并稀釋至1 000m L，即得）；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Lichrospher C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-50mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液（20∶80），流速：1.0m L·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。理論板數(shù)按腺苷和別嘌呤醇峰計(jì)算不低于1 200。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液。精密稱取腺苷對(duì)照品30mg，置于10m L量瓶中，甲醇溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，即得腺苷對(duì)照品貯備液。精密稱取別嘌呤醇對(duì)照品約30mg，置于100m L量瓶中，甲醇溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，即得別嘌呤醇對(duì)照品貯備液。分別精密移取2種對(duì)照品貯備液各0.5m L，置于10m L量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液。精密移取器官保存液樣品1m L，置于10 m L量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取樣品溶液5份，分別加入0.2mol·L－1NaOH溶液、1 mol·L－1H2SO4溶液、5%雙氧水溶液破壞3 h，在100℃加熱1 h和5 000 lx強(qiáng)光照射3 h，在各條件下破壞后測(cè)定。結(jié)果，腺苷和別嘌呤醇降解產(chǎn)物均能與二者較好地分離，詳見圖1A～E。另取輔料（即水）進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果基線平穩(wěn)，表明其對(duì)主成分測(cè)定無干擾，證明該條件可以用于腺苷和別嘌呤醇的含量測(cè)定，詳見圖1F。對(duì)照品色譜見圖1G。

圖1 高效液相色譜圖A.堿破壞后樣品；B.酸破壞后樣品；C.氧化破壞后樣品；D.熱破壞后樣品；E.光破壞后樣品；F.水；G.對(duì)照品；1.腺苷；2.別嘌呤醇Fig 1 HPLC chrom atogram sA.samples treated with alkali；B.samples treated with acid；C.samples treated with oxidation；D.samples treated with heat；E.samples treated with highlight；F.water；G.substance control；1.adenosine；2.allopurinol

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取腺苷和別嘌呤醇對(duì)照品貯備液各5.0m L，置于50m L量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取該溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0m L，置于10m L量瓶中，加流動(dòng)相定量稀釋成系列濃度，進(jìn)樣測(cè)定。以濃度（c）與峰面積（A）進(jìn)行回歸分析，得腺苷、別嘌呤醇的回歸方程分別為：A＝3.116×104c+9.081×103（r＝0.999 9）、A＝2.775×104c－2.425×103（r＝0.999 9），表明二者檢測(cè)濃度線性范圍分別為0.03～0.3、0.003～0.03mg·m L－1。

2.5 定量限和檢測(cè)限試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)溶液（腺苷、別嘌呤醇濃度分別為0.03、0.003mg·m L－1），用流動(dòng)相稀釋制成一系列濃度的溶液，搖勻，進(jìn)樣測(cè)定。經(jīng)計(jì)算得腺苷的定量限和檢測(cè)限分別為7.5（S/N≥10）、3.7 ng·m L－1（S/N≥3）；別嘌呤醇的定量限和檢測(cè)限分別為7.6（S/N≥10）、3.8 ng·m L－1（S/N≥3）。

2.6 回收率試驗(yàn)

分別精密取腺苷對(duì)照品、別嘌呤醇對(duì)照品及水，混勻并制成含腺苷和別嘌呤醇80%、100%、120%處方量的模擬制劑。分別取該模擬制劑按照“2.9”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，計(jì)算低、中、高濃度回收率。結(jié)果腺苷和別嘌呤醇的平均回收率分別為99.14%和99.11%，表明本方法回收率良好，詳見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Resultsof recovery test（n＝3）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品溶液10m L，室溫下避光放置，分別在0、0.5、1、2、4、8、16 h取1m L，經(jīng)處理后進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果16 h內(nèi)腺苷以及別嘌呤醇峰面積沒有明顯變化，RSD均為0.55%，表明器官保存液含量測(cè)定溶液避光放置在16 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.8 精密度試驗(yàn)

2.8.1 進(jìn)樣精密度。取腺苷和別嘌呤醇對(duì)照品溶液各重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果RSD分別為0.63%、0.58%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.8.2 重復(fù)性。取同1批樣品同日內(nèi)共分析6次，結(jié)果腺苷和別嘌呤醇RSD分別為0.46%、0.54%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8.3 中間精密度。3位操作者分別在不同時(shí)間、采用不同儀器測(cè)定同1批樣品的含量，計(jì)算含量，結(jié)果腺苷平均含量為96.2%，RSD＝0.44%；別嘌呤醇平均含量為91.8%，RSD＝0.55%。表明方法中間精密度良好。

2.9 含量測(cè)定

精密移取3批器官保存液樣品1m L，置于10m L量瓶中，甲醇稀釋至刻度，進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果，腺苷含量分別為98.3%、96.2%、98.0%，別嘌呤醇含量分別為96.7%、95.8%、97.2%。

3 討論

（1）波長(zhǎng)的選擇。在“2.1”項(xiàng)流動(dòng)相條件下，腺苷和別嘌呤醇的最大吸收波長(zhǎng)分別為280、260 nm。因樣品中別嘌呤醇含量較低，故選擇260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在該波長(zhǎng)處，腺苷和別嘌呤醇都具有較強(qiáng)的吸收，有良好的靈敏度，符合試驗(yàn)的要求。

（2）流動(dòng)相的選擇。參考文獻(xiàn)[6]條件并通過試驗(yàn)調(diào)整優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)甲醇-50mmol·L－1磷酸二氫鉀比例為20∶80時(shí)，腺苷和別嘌呤醇均能得到較好分離，且降解產(chǎn)物無干擾，最終確定了此流動(dòng)相。

本文建立的分析方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便易行，可用于器官保存液中腺苷和別嘌呤醇的含量測(cè)定。

[1]朱有華，張 雷.器官保存研究的新進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)進(jìn)修雜志，2006，34（1）：12.

[2]覃 珍，陳 超.別嘌醇研究的新進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（11）：1 220.

[3]鄭軍華，閔志廉，李玉莉，等.自制長(zhǎng)征-1號(hào)多器官保存液的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和部分臨床應(yīng)用研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，20（6）：341.

[4]段桂新.器官保存的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2006，19（8）：745.

[5]朱水波，殷桂林，孫宗全，等.腺苷預(yù)處理保存供心的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床外科雜志，2003，8（11）：4.

[6]樓麗君，周靜安.反相高效液相色譜法測(cè)定靈芝及其制劑中腺苷的含量[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24（12）：2 332.