宋和梅（連云港市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港 222002）

環(huán)孢素A（Cyclosporine A，CsA）具有強(qiáng)大的免疫抑制作用，主要用于器官移植術(shù)后的抗排異治療和預(yù)防，由于其治療窗狹窄、藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異大，臨床應(yīng)用需要對(duì)其實(shí)施治療藥物監(jiān)測(cè)，優(yōu)化給藥方案，減少其毒副反應(yīng)的發(fā)生，提高移植的成功率。當(dāng)前，監(jiān)測(cè)CsA血藥濃度的分析方法主要是免疫分析（IA）法和高效液相色譜（HPLC）法。IA法主要包括熒光偏振免疫（FPIA）法、酶放大免疫分析（EMIT）法和放射免疫分析（RIA）法。RIA法因放射性污染、特異性較差已少用；FPIA法由于操作簡(jiǎn)便、快捷被臨床廣泛使用，近期因試劑供應(yīng)問題國(guó)內(nèi)已停止使用；與此同時(shí)，EMIT法得到了快速推廣，但EMIT法試驗(yàn)條件苛刻，試劑的穩(wěn)定性和重復(fù)性不及FPIA法。本試驗(yàn)建立了快速、靈敏、準(zhǔn)確、實(shí)用的全血CsA濃度HPLC分析方法，以滿足CsA治療藥物監(jiān)測(cè)的需要。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀，包括600E四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、996二極管陣列檢測(cè)器、Empower色譜工作站、Empower System Suitability軟件（美國(guó)Waters公司）；Milli-Q超純水器（美國(guó)密里博公司）；AE240電子分析天平（瑞士Mettler公司）；MS2振蕩器（德國(guó)IKA公司）；干熱式樣品濃縮器（美國(guó)Pierce公司）；TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；溶劑過濾器（天津市威儀科技發(fā)展有限公司）；HP-01無油真空泵（天津市鑫洲科技有限公司）。

1.2 試藥

CsA（純度：99%）、環(huán)孢素D（CsD）（內(nèi)標(biāo)，純度：95%）均為福建微生物研究所提供；甲醇、乙腈為色譜純，乙醚（使用前重蒸）、氫氧化鈉、鹽酸、正己烷為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Nova-pak C1（8150 mm×3.9 mm，4 μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水（30.8∶51.2∶18）；流速：1 mL·min－1；柱溫：55℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL；內(nèi)標(biāo)：CsD。在該色譜條件下，CsA、CsD保留時(shí)間分別約為4.5、5.6 min，CsA理論板數(shù)＞1028，對(duì)稱因子為1.032，容量因子為3.538，與CsD分離良好，分離度（Rs）為1.507，無雜峰干擾。高效液相色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.標(biāo)準(zhǔn)血樣；B.空白血樣；C.患者血樣；1.CsA；2.CsDFig 1 HPLC chromatogramA.standard blood sample；B.blank blood sample；C.blood sample of patients；1.CsA；2.CsD

2.2 溶液的配制

2.2.1 流動(dòng)相的配制：按30.8∶51.2∶18體積比例分別量取乙腈、甲醇、超純水適量，混勻，用0.45 μm孔徑的濾膜真空抽濾，得上述比例的乙腈-甲醇-水流動(dòng)相，使用前超聲脫氣10 min備用。

2.2.2 工作溶液：快速稱取氫氧化鈉1.0 g置于1 000 mL容量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為0.025 mo1·L－1的氫氧化鈉溶液備用。另精密量取36.5%的濃鹽酸2.5 mL置于1 000 mL容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻，配成濃度為0.025 mo1·L－1的鹽酸溶液備用。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取CsA1.94 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密吸取2 mL于50 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，配成濃度為3.1 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液使用，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取CsD 10.54 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密吸取5 mL于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成濃度為21 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)含藥全血：分別精密吸取CsA標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、200、400、800、1 500 μL，吹干，加空白全血3.0 mL，配成濃度為51.67、103.33、206.67、413.33、826.67、1 550.00 ng·mL－1的含藥全血。

2.3 血樣采集

79例移植患者，行CsA谷濃度（c0）或峰濃度（c2）常規(guī)監(jiān)測(cè)。c0于清晨服藥前半小時(shí)內(nèi)、c2于清晨服藥后（120±15）min內(nèi)采靜脈血4 mL于肝素抗凝試管中，供CsA血藥濃度測(cè)定使用。

2.4 樣品處理

取含藥全血3.0 mL，加CsD內(nèi)標(biāo)溶液100 μL、0.025 mol·L－1氫氧化鈉溶液3.0 mL，混勻，用乙醚萃取3次（4、3、3 mL），每次離心（3 500 r·min－1）4 min，合并乙醚萃取液，吹干；殘?jiān)蛹状肌?.025 mol·L－1鹽酸溶液各1.0 mL，復(fù)溶；復(fù)溶液用正己烷萃取2次（3、3 mL），每次離心（3 500 r·min－1）3 min，棄上層正己烷，水層加0.025 mol·L－1氫氧化鈉溶液2.0 mL，混勻；再用乙醚萃取水層2次（3、3 mL），每次離心（3 500 r·min－1）3 min，合并乙醚萃取液，吹干；用流動(dòng)相100 μL復(fù)溶，20 μL進(jìn)樣。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)含藥全血3.0 mL，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，記錄色譜。以CsA濃度（c）對(duì)CsA與CsD峰面積比值（y）作線性回歸，得回歸方程：c＝411.71y+6.30（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，CsA濃度在50～1 550 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 回收率及精密度試驗(yàn)

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)含藥全血3.0 mL，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，分別于當(dāng)日和連續(xù)6 d內(nèi)測(cè)定CsA濃度，計(jì)算回收率及日內(nèi)、日間RSD。另取上述含藥全血3.0 mL，同法測(cè)定，計(jì)算CsA與內(nèi)標(biāo)CsD的峰面積比值Y1；取3.0 mL空白全血6份，按”2.4”項(xiàng)下方法操作，止于“用流動(dòng)相100 μL復(fù)溶”前，在6支尖底試管中分別加CsA標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、200、400、800、1 500 μ L，吹干，用流動(dòng)相100 μL復(fù)溶進(jìn)樣，計(jì)算CsA與內(nèi)標(biāo)CsD的峰面積比值Y2；計(jì)算CsA提取回收率（Y1/Y2×100%）?；厥章始熬芏仍囼?yàn)結(jié)果見表1。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery and precision tests

2.7 穩(wěn)定性考察

取標(biāo)準(zhǔn)含藥全血分別于室溫存放0、6、24、72 h后測(cè)定CsA濃度，結(jié)果RSD＜6%（1.95%～5.98%，n＝6），表明樣本室溫存放72 h對(duì)CsA測(cè)定結(jié)果沒有影響（P＞0.05），即樣本在室溫存放72 h是穩(wěn)定的。

2.8 干擾試驗(yàn)

將移植患者常用的藥物，如潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、氫化可的松、硫唑嘌呤、霉酚酸酯（驍悉）、地爾硫、硝苯地平、酮康唑、頭孢唑林、阿莫西林等加入空白全血中，使成適當(dāng)濃度，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果上述藥物均不干擾全血中CsA的分離與測(cè)定。

2.9 CsA全血濃度監(jiān)測(cè)

對(duì)79例移植患者413次全血濃度監(jiān)測(cè)，其中腎移植36例，肝移植26例，骨髓移植17例，年齡33～62歲。測(cè)得c2（858.17±410.98）ng·mL－1（n＝144），范圍為269.13～2 365.80 ng·mL－1，c0測(cè)得254.77±134.98 ng·mL－1（n＝269），范圍為38.13～785.60 ng·mL－1。

3 討論

乙醚對(duì)CsA萃取效率最高[1]，但分析純乙醚含有較多的過氧化物等雜質(zhì)，直接使用對(duì)色譜圖產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，以致于使測(cè)定無法進(jìn)行，且不同廠家和不同批次間存在差異，重蒸后雜峰消失，使色譜圖得以凈化，減少對(duì)色譜柱的污染[1，2]。因此，使用重蒸乙醚非常關(guān)鍵。

李海菊等[1]認(rèn)為樣品中水的含量是影響CsA萃取回收率的主要因素，水含量越高，萃取回收率越低，故樣品處理時(shí)盡量少加含水的試液。如果對(duì)“2.4”項(xiàng)下含水試劑氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液的濃度進(jìn)行優(yōu)化，減少使用體積，CsA提取回收率可能會(huì)更高。CsA不溶于正己烷，在酸性條件下用正己烷洗滌乙醚提取物，能夠去除乙醚提取物中脂溶性干擾物，純化樣品[3]。馮惠平等[4]發(fā)現(xiàn)隨鹽酸濃度的增大，正己烷的脫脂去除雜質(zhì)能力增強(qiáng)，色譜圖雜峰更少。

分析CsA血藥濃度的HPLC法絕大多數(shù)使用反相高效液相色譜法，常用色譜柱有C18、C8和氰基柱，氰基柱所需柱溫較低（55 ℃）[1]，C8柱次之（60 ℃），C18柱較高（60～72 ℃）[2～4]，方能獲得較好的柱效，但柱溫太高可加速色譜柱硅膠鍵合相的斷裂，使柱效下降，縮短色譜柱的壽命。筆者觀察了溫度對(duì)CsA和CsD色譜行為的影響，發(fā)現(xiàn)升高柱溫保留時(shí)間稍有減少，但峰形和分辨率改善有顯著意義，在55℃時(shí)就能獲得滿意的峰形和分辨率，且有利于色譜柱的保護(hù)，降低分析成本。然而，樣品上柱運(yùn)行時(shí)間不能＜10 min，因?yàn)樵?.4、9.6、12.3 min時(shí)各有一個(gè)內(nèi)源性雜質(zhì)峰，測(cè)定時(shí)應(yīng)避開。

本法經(jīng)臨床79例移植患者413次全血CsA濃度監(jiān)測(cè)驗(yàn)證，本法具有穩(wěn)定性好、線性范圍寬、柱溫低、靈敏準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，非常適合臨床CsA治療藥物監(jiān)測(cè)和藥動(dòng)學(xué)研究。

[1]李海菊，楊 娟，王 峰，等.RP-HPLC測(cè)定全血中環(huán)抱素A[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40（11）：857.

[2]李碧峰，馮惠平，賈晉蓉，等.反相高效液相色譜法測(cè)定全血中環(huán)抱素的濃度[J].中國(guó)藥師，2007，10（7）：649.

[3]李 航，胡正波，魏志奇.反相高效液相色譜法測(cè)定環(huán)孢素A的血藥濃度[J].中國(guó)藥業(yè)，2009，18（15）：9.

[4]馮惠平，李碧峰，陳宜鋒，等.改良RP-HPLC測(cè)定全血中環(huán)孢素A的濃度[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27（5）：433.