吳志軍，王艷紅，韓俊芬，姚建波，王彥杰，陳志寶

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

表面活性劑是一類同時(shí)具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的兩性化合物，具有顯著降低相界面表面張力的功能[1]。微生物在一定條件下培養(yǎng)也可以分泌表面活性劑，生物表面活性劑主要包括糖脂、脂肽、脂蛋白等。與化學(xué)表面活性劑相比，具有產(chǎn)量高、毒性小、成本低、可降解等顯著優(yōu)點(diǎn)[2]，在化工、食品、石油等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[3]。

Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)是由Plackett 和Burman 于1946年提出的2 水平的部分因子設(shè)計(jì)方法[4]。可以利用最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)從眾多因素中快速有效地篩選出主要的影響因素，Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Hadamard 矩陣進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過N 次實(shí)驗(yàn)可以研究N-1 個(gè)因素。在試驗(yàn)中每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平，高水平取低水平的1.25 倍左右[5]；對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，可以得到一階線性模型，通過模型的各項(xiàng)系數(shù)比較能分析各因素的顯著性水平，篩選出重要因子[6]。由于它具有快速高效等突出優(yōu)點(diǎn)，Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)在生物、化工、制藥、食品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[7-9]。

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis-1101 為石油中分離出的產(chǎn)表面活性劑的菌株，以表面活性劑的產(chǎn)量為目標(biāo)，通過Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用排油圈法對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行初步優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

菌株：Bacillus subtilis-1101 從石油中分離出的，由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 LB 種子培養(yǎng)基（g·L-1）

氯化鈉10，胰蛋白胨10，酵母提取物5。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

參考畢思寧等人的培養(yǎng)方法[10]，培養(yǎng)基包括以下成分（g·L-1）：NaNO3、（NH4）2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、CaCO3、液體石蠟。以上成分按試驗(yàn)方案配置后在121 ℃滅菌20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

菌株在種子培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h 后，將發(fā)酵液按照5%接種量置入裝有一定量新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，在一定pH 值、搖床轉(zhuǎn)速為170 rpm下培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

1.4 表面活性劑測(cè)定方法

參考畢思寧等人的排油圈檢測(cè)法[10]，采用蘇丹紅Ⅲ染色，將0.5 g 蘇丹紅Ⅲ溶于100 mL 液體石蠟，攪拌均勻后，過濾除去雜質(zhì)。取10 mL 蘇丹紅Ⅲ染色的液體石蠟加入盛有40 mL 蒸餾水的直徑9 cm 培養(yǎng)皿中。用微量移液器加入1 mL 發(fā)酵液，測(cè)量排油圈直徑，以排油圈直徑大小表示表面活性劑產(chǎn)量的多少。每個(gè)處理重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)影響表面活性劑產(chǎn)生的NaNO3、（NH4）2SO4、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCO3、初始pH 值、裝液量、液體石蠟等10 個(gè)因素為考察變量，每個(gè)因素選取高低兩個(gè)水平，分別編碼為+1 和-1，因素編碼與水平見表1。按照Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用Minitab15.0 設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案和數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Experimental range and levels of the independent variables used in the Plackett-Burman design

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Plackett-Burman design and results

2.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果分析

利用minitab15.0 對(duì)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到排油圈直徑與各因素之間的回歸方程Y=5.696+0.13A-0.014B+0.15C+0.31D-0.13E+0.14F-0.096G-0.054H-0.184I-0.296J，各因子對(duì)響應(yīng)值的效應(yīng)可從方差分析表3 看出，在10 個(gè)因素中，KCl、裝液量、液體石蠟的量三個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響達(dá)到顯著水平，其中，因素KCl 對(duì)響應(yīng)值的為正效應(yīng)，裝液量、液體石蠟則為負(fù)效應(yīng)。其他因素則對(duì)目標(biāo)值則沒有顯著影響。這點(diǎn)也可以從圖1 中的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto 圖看出。方差分析結(jié)果表明，模型決定系數(shù)R2為0.999 5，較好的描述了表面活性劑的產(chǎn)生過程。

表3 模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the first order model determined from the Plackett-Burman design

圖1 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto 圖Fig.1 Pareto chart of standardized effects

3 結(jié)論

采用12 次Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)影響枯草芽孢桿菌-1101 表面活性劑產(chǎn)生的培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步篩選，結(jié)果表明，在10 個(gè)因素中，KCl 的量、裝液量、液體石蠟三個(gè)因素對(duì)表面活性劑的產(chǎn)生有顯著影響。其他因素不顯著。此結(jié)果為下一步的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)提供了一定的依據(jù)。

［1］Vaz D.A.，Gudin~a E.J.，Alameda E.J.，et al.Performance of a biosurfactant produced by a Bacillus subtilis strain isolated from crude oil samples as compared to commercial chemical surfactants ［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2012，89（10）: 167-174.

［2］Nitschke M.，Pastore G.M.Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater［J］.Bioresource Technology，2006，97（2）: 336-341.

［3］Ghojavand H.，Vahabzadeh F.，Roayaei E.，et al.Production and properties of a biosurfactant obtained from a member of the Bacillus subtilis group （PTCC 1696）［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2008，324（12）：172-176.

［4］Plackett R.L，,Burman J.P.The design of optimum multifactor experiments［J］.Biometrika，1946，33: 305-325.

［5］鄭輝杰.用基因組重排和進(jìn)化工程進(jìn)行菊糖芽孢乳桿菌菌種改進(jìn)［D］.天津:天津大學(xué)，2009.

［6］Rao P.，Divakar S.Lipase catalyzed esterification of αterpineol with various organic acids: application of the Plackett -Burman design ［J］.Process Biochemistry，2001，36（11）: 1125-1128.

［7］Bakonyi P.，Nemestóthy N.，Lo¨vitusz，et al.Application of Plackett -Burman experimental design to optimize biohydrogen fermentation by E.coli （XL1-BLUE）［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2011，36（21）:13949-13954.

［8］Chauhan K.，Trivedi U.，Patel K.C.Statistical screening of medium components by Plackett-Burman design for lactic acid production by Lactobacillus sp.KCP01 using date juice［J］.Bioresource Technology，2007，98（1）: 98-103.

［9］Reddy L.V.A.，Wee Y.J.，Yun J.S.，et al.Optimization of alkaline protease production by batch culture of Bacillus sp.RKY3 through Plackett-Burman and response surface methodological approaches［J］.Bioresource Technology，2008，99（7）: 2242-2249.

［10］畢思寧，王彥杰，左豫虎.生物表面活性劑排油圈檢測(cè)方法的改進(jìn)和應(yīng)用［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，22（6）: 58-60.