廖 輝，曾昭靜，呂小平，詹靈凌，陳 蘭

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院西院，廣西南寧530021;2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)部)

炎癥性腸病(IBD)是一組慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便，具有慢性和消耗性的特征，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。該病在歐美國(guó)家發(fā)病率比較高，近年我國(guó)的發(fā)病率及患病率也在上升。至今IBD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前公認(rèn)，免疫調(diào)節(jié)異常在IBD發(fā)生發(fā)展中起重要作用。已有研究表明，IL-23/IL-17軸在IBD的發(fā)病機(jī)制中可能處于關(guān)鍵地位［1，2］，并有望成為 IBD 新的治療靶標(biāo)?，F(xiàn)階段，IBD的治療手段非常有限，藥物治療主要以5-氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑為主，但都存在不同的局限性和毒副作用。姜黃素是從姜科植物中提取的一種相對(duì)分子質(zhì)量小的多酚類物質(zhì)，具有一定的免疫調(diào)節(jié)、炎癥抑制功能。2010年6月～2011年5月，本研究應(yīng)用姜黃素干預(yù)實(shí)驗(yàn)性大鼠結(jié)腸炎模型，探討其對(duì)IL-23表達(dá)的影響及對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠結(jié)腸炎的治療作用，進(jìn)一步研究IBD的病因和發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康成年雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要試劑:姜黃素購(gòu)自BBI公司、三硝基苯磺酸(TNBS)購(gòu)自sigma公司、柳氮磺吡啶(SASP)購(gòu)自上海三維藥業(yè)有限公司、抗體購(gòu)自santa cruz公司，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立 將80只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、姜黃素組、SASP組，每組均為20只。模型組、姜黃素組、SASP組大鼠分別以100 mg/kg TNBS乙醇溶液灌腸制備大鼠結(jié)腸炎模型，TNBS模型參照Morris等方法制作:大鼠禁食24 h，水合氯醛麻醉后由肛門(mén)插入硅膠管至腸道內(nèi)約8 cm，一次性結(jié)腸灌注100 mg/kg TNBS(溶于50%乙醇溶液，總體積為1 mL)，提起尾部倒立3 min后，放回籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。正常對(duì)照組予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液灌腸;正常對(duì)照組、模型組每日予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃;姜黃素組自造模第2天起每日予100 mg/kg姜黃素溶液灌胃;SASP組大鼠也于造模第2天每日予100 mg/kg的SASP溶液灌胃。造模第8天處死大鼠，采集大鼠結(jié)腸標(biāo)本備檢。

1.2.2 癥狀、體征觀察及評(píng)分 造模后觀察各組大鼠體質(zhì)量變化、大便性狀、便血情況，參照Okayasu等［3］的經(jīng)典評(píng)分系統(tǒng)方法，每日將體質(zhì)量下降、大便性狀和隱血或便血情況的評(píng)分相加，作為疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)(DAI=體質(zhì)量減輕率分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+隱血程度分?jǐn)?shù)/3)。

1.2.3 標(biāo)本采集及結(jié)腸黏膜組織學(xué)損傷評(píng)分 光鏡觀察結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)變化，并進(jìn)行炎癥損傷評(píng)分:造模第8天處死大鼠，距肛門(mén)2、6、10 cm處取3段長(zhǎng)約1 cm的大鼠結(jié)腸組織，制備石蠟切片，行蘇木精—伊紅(HE)染色，以盲法觀察，在光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜損傷情況，參照 Butzner等［4，5］CMDI、Dieleman評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

1.2.4 腸黏膜組織IL-23 mRNA水平的測(cè)定 采用RT-PCR法。按Trizol法提取各組大鼠結(jié)腸組織總RNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度之后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，并取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA用于PCR擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像，目標(biāo)mRNA的表達(dá)量使用內(nèi)參照β-actin進(jìn)行校正。紫外燈下以凝膠圖像掃描儀測(cè)A值，用GAPDH校正半定量，計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。RT-PCR引物序列:IL-23 p19:上游引物:5'-CTGACAGACTCTGCTTCCTCGCTAC-3';下游引物:5'-CGAACAGCCCGAGATAGGACAAG-3'(355 bp);β-actin:上游引物:5'-CCCATACCCAC CATCACACC-3';下游引物:5'-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'(207 bp)。RT-PCR反應(yīng)條件:PCR Mix 12.5 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模版1.5 μL，加DEPC-treated water至25μl。反應(yīng)條件為:95℃，5 min;94 ℃，30 s;55 ℃，30 s;72 ℃，45 s，共 35個(gè)循環(huán);最后72℃，7 min。

1.2.5 腸黏膜組織IL-23蛋白表達(dá)水平的測(cè)定

采用Western blot提取各組大鼠腸黏膜組織中的總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定總蛋白濃度。蛋白經(jīng)過(guò)10%SDS-PAGE電泳后，將凝膠中蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉TBS液封閉后，加入一抗搖床孵育過(guò)夜，洗滌后加入二抗，室溫孵育80 min后，ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色后曝光顯影。目標(biāo)條帶使用圖像分析軟件進(jìn)行分析，目標(biāo)蛋白表達(dá)量使用β-actin進(jìn)行校正。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料以ˉx±s表示，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)檢驗(yàn);兩變量間相關(guān)關(guān)系的分析采用直線相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況、結(jié)腸組織大體形態(tài)及組織學(xué)評(píng)分 見(jiàn)表1、圖1。

2.2 各組結(jié)腸組織IL-23的表達(dá) 見(jiàn)表2、圖2、圖3。

表1 各組DAI及腸黏膜組織損傷評(píng)分(分，ˉx±s)

圖1 結(jié)腸組織鏡下觀察(HE×200)

表2 各組大鼠結(jié)腸組織IL-23 mRNA和蛋白的表達(dá)(ˉx±s)

圖2 各組結(jié)腸組織IL-23 mRNA表達(dá)

圖3 各組結(jié)腸組織IL-23蛋白表達(dá)

3 討論

IBD是一組病因未明的非特異慢性腸道炎癥性疾病，現(xiàn)已成為消化系統(tǒng)常見(jiàn)病及慢性腹瀉的主要病因。其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，有研究顯示，腸壁黏膜免疫調(diào)節(jié)異常、持續(xù)腸道感染、腸壁黏膜屏障缺損、遺傳和環(huán)境等因素共同參與該疾病的發(fā)生發(fā)展［6，7］，其中先天性免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)異常在IBD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［8］。

IL-23是IL-12分子家族中的促炎性細(xì)胞因子，主要是由激活的單核—巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞分泌，由IL-12p40和IL-23p19亞單位組成。IL-23具有十分復(fù)雜的生物學(xué)功能，參與機(jī)體控制感染和自身免疫性疾病發(fā)生［9～11］。其主要介導(dǎo) Th17細(xì)胞群的擴(kuò)增并維持其存活，Th17細(xì)胞主要介導(dǎo)機(jī)體的炎性反應(yīng)(防御胞外病原菌的感染)、自身免疫反應(yīng)、IBD、腫瘤和移植排斥等的發(fā)生和發(fā)展，具有高致病性［10］。研究表明，IL-23在某些自身免疫性疾病中的表達(dá)增高，如實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性腦脊髓炎、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎及人類銀屑病等［12］。近年國(guó)外研究證實(shí)，IL-23 在 IBD 的發(fā)生中起重要作用［10，13］，其可通過(guò)誘導(dǎo)并驅(qū)動(dòng)Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17、IL-6和TNF-α等，引起炎癥細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成結(jié)腸炎癥。劉占舉等［14］發(fā)現(xiàn) IL-23在 IBD中表達(dá)增高，并能誘導(dǎo)IBD患者淋巴細(xì)胞效應(yīng)應(yīng)答，促使腸黏膜炎性反應(yīng)，尤其是CD患者腸黏膜炎性肉芽腫形成，導(dǎo)致黏膜組織損傷、腸壁黏膜增厚。

已有研究表明，IL-23/IL-17軸在IBD的發(fā)病機(jī)制中可能處于關(guān)鍵地位［1，2］。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，敲除IL-23和IL-12共有的p40基因或用單克隆抗體中和治療處理后TNBS未能誘發(fā)出小鼠結(jié)腸炎［2］。Kullberg 等［15］在小鼠結(jié)腸炎模型中，通過(guò)將幼稚的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至免疫缺陷型、RAG基因敲除小鼠中，引起宿主腸道感染，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎在p19和p40缺陷型小鼠中可被抑制，而在IL-12特異性亞基p35缺陷型小鼠中不能被抑制，結(jié)腸炎的抑制程度與炎性因子TNF、IL-6、IFN-γ的減少有相關(guān)性?？梢?jiàn)，IL-23通過(guò)激活潛在的 T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在腸道感染的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。有關(guān)人體IBD的研究發(fā)現(xiàn)，IL-23p19 mRNA在 CD患者的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，在UC患者輕度升高，在特異性腸炎和正常人中沒(méi)有升高［16］。Fuss等［17］也發(fā)現(xiàn) CD患者中IL-23水平升高，并且用 IL-12p40 mAb治療后IL-23的水平下降。以上結(jié)果均提示IL-23在IBD的發(fā)病機(jī)制中可能起關(guān)鍵作用。

本實(shí)驗(yàn)采用Western blot法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織的IL-23p19蛋白水平，RT-PCR法測(cè)大鼠結(jié)腸組織IL-23 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的IL-23 mRNA和蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比均顯著升高，且與疾病活動(dòng)指數(shù)呈正相關(guān)，與Yen等［18］研究結(jié)果一致，提示IL-23在大鼠結(jié)腸炎的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。

國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，姜黃素可調(diào)控IBD大鼠模型中的炎癥因子表達(dá)，簡(jiǎn)燕婷等［19］用姜黃素干預(yù)IBD大鼠模型發(fā)現(xiàn)能使腸黏膜細(xì)胞致炎因子IL-1β mRNA的表達(dá)受抑制，而抗炎因子IL-10 mRNA的表達(dá)增強(qiáng);夏劍等［20］報(bào)道實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中，姜黃素通過(guò)抑制NF-κB、TNF-α表達(dá)而達(dá)到抗炎效果;張明等［21］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素抗炎作用與抑制IL-12調(diào)節(jié)Thl/Th2細(xì)胞因子平衡有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠精神差、毛色粗糙、排血便或無(wú)排便，體質(zhì)量明顯下降，至造模結(jié)束仍低于造模前水平，炎性指標(biāo)IL-23 mRNA及蛋白表達(dá)顯著增高;姜黃素組大鼠經(jīng)姜黃素治療后上述改變均得到明顯改善，體質(zhì)量逐漸恢復(fù)或超越造模前水平，大鼠的DAI、大體形態(tài)和組織學(xué)損傷情況均明顯降低，IL-23 mRNA及蛋白表達(dá)下降。說(shuō)明姜黃素能夠降低IL-23的蛋白及mRNA表達(dá)水平，對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠結(jié)腸炎有明顯的抑制作用，其是治療IBD大鼠模型的有效藥物。

［1］Iwakura Y，Ishigame H.The IL-23/IL-17 axis in inflammation［J］.J Clin Invest，2006，116(5):1218-1222.

［2］Bamias G，Cominelli F.Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease:current concepts［J］.Curr Opin Gastroenterol，2007，23(4):365-369.

［3］Okayasu I，Hatakeyama S，Yamada M，et al.A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice［J］.Gastroenterology，1990，98(3):694-702.

［4］Butzner JD，Parmar R，Bell CJ，et al.Butyrate enema therapy stimulates mucosal repair in experimental colitis in the rat［J］.Gut，1996，38(4):568-573.

［5］Dieleman LA，Palmen MJ，Akol H，et al.Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium(DSS)is characterized by Th1 and Th2 cytokines［J］.Clin Exp Immunol，1998，114(3):385-391.

［6］Gismera CF，Aladrén BS.Imflammatory bowel diseases:a disease(s)of modern times?Is incidence still increasing［J］.World JGastroenterol，2008，14(36):5491-5498.

［7］呂小平，詹靈凌，姜海行，等.炎癥性腸病腸上皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白激酶對(duì)NAP-2的影響［J］.世界華人消化雜志，2006，14(25):2510-2515.

［8］Andoh A，Yagi Y，Shioya M，et al.Mucosal cytokine network in imflammatory bowel disease［J］.World J Gastroenterol，2008，14(33):5154-5161.

［9］劉占舉，王麗萍.腸黏膜先天性免疫應(yīng)答與炎癥損傷［J］.胃腸病學(xué)，2007，12(2):120-123.

［10］Oppmann B，Lesley R，Blom B，et al.Novel p19 protein engages-IL-12p40 to form a cytokine，IL-23，with biological activities similar as well as distinct from IL-12［J］.Immunity，2000，13(5):715-725.

［11］Lankford CS，F(xiàn)rucht DM.A unique role for IL-23 in promoting cellular immunity［J］.J Leukoc Biol，2003，73(1):49-56.

［12］Carmody RJ，Ruan Q，Liou HC，et al.Essential roles of c-Rel in TLR-induced IL-23 p19 gene expression in dendritic cells［J］.JImmunol，2007，178(1):186-191.

［13］Parham C，Chirica M，Timans J，et al.A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12Rbeta1 and a novel cytokine receptor subunit，IL-23R［J］.J Immunol，2002，168(11):5699-5708.

［14］劉占舉，楊麗，崔軼，等.白細(xì)胞介素-23在炎癥性腸病的表達(dá)升高并誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子分泌［J］.中華消化雜志，2009，29(6):370-373.

［15］Kullberg MC，Jankovic D，F(xiàn)eng CG，et al.IL-23 plays a key role in Helicobacter hepaticus-induced T cell-dependent colitis［J］.J Exp Med，2006，203(11):2485-2494.

［16］Schmidt C，Giese T，Ludwig B，et al.Expression of interleukin-12-related cytokine transcripts in inflammatory bowel disease:elevated interleukin-23p19 and interleukin-27p28 in Crohn’s disease but not in ulcerative colitis［J］.Inflamm Bowel Dis，2005，11(1):16-23.

［17］Fuss IJ，Becker C，Yang Z，et al.Both IL-12p70 and IL-23 are synthesized during active Crohn’s disease and are down-regulated by treatment with anti-IL-12 p40 monoclonal antibody［J］.Inflamm Bowel Dis，2006，12(1):9-15.

［18］ Yen D，Cheung J，Scheerens H，et al.IL-23 is essential for T cell-mediated colitis and promotes inflammation via IL-17 and IL-6［J］.JClin Invest，2006，116(5):1310-1316.

［19］簡(jiǎn)燕婷，王繼德，麥國(guó)豐，等.姜黃素對(duì)模型大鼠腸粘膜炎癥因子的調(diào)控［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(12):1353-1359.

［20］夏劍，鄧長(zhǎng)生，張孫，等.姜黃素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜內(nèi)NF-κB 及 TNF-α表達(dá)的影響［J］.世界華人消化雜志，2005，13(2):255-257.

［21］張明，鄧長(zhǎng)生，鄭家駒，等.姜黃素對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型細(xì)胞因子的影響［J］.中華消化雜志，2006，26(11):731-734.