高艷周，王小燕，李紅霞，韓蓮花，李 勛

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006)

體內(nèi)活性氧產(chǎn)生超過內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力時(shí)便發(fā)生氧化應(yīng)激，研究表明氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化等血管性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。近來發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶是心血管系統(tǒng)產(chǎn)生活性氧的主要來源［1］。他汀類藥物除調(diào)脂作用外，尚具抗氧化作用，但其作用機(jī)制尚不十分清楚。2010年6月～2011年5月，本研究通過建立大鼠心肌梗死(心梗)模型，并予阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)，測(cè)定主動(dòng)脈平滑肌超氧陰離子()濃度及Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表達(dá)，旨在探討心梗后平滑肌NADPH氧化酶的變化及阿托伐他汀對(duì)其干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，測(cè)定試劑盒購自江蘇碧云天生物試劑公司，RT-PCR試劑盒購自美國Fer-mentas公司，引物購自上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 取體質(zhì)量230～260 g雄性SD大鼠，用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)行腹腔麻醉，開胸暴露心臟結(jié)扎左前降支為手術(shù)組，僅穿線而不結(jié)扎為假手術(shù)組，手術(shù)組大鼠于術(shù)后第二天隨機(jī)給予10 mg/(kg·d)阿托伐他汀或等體積生理鹽水灌胃5周，設(shè)為心梗干預(yù)組和心梗組。術(shù)后第6周共存活大鼠20只，其中假手術(shù)組6只，心梗組8只，心梗干預(yù)組6只;用10%水合氯醛麻醉并開胸取胸主動(dòng)脈平滑肌。

1.2.3 Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表達(dá)水平測(cè)定采用RT-PCR法。取大鼠主動(dòng)脈平滑肌組織按Trizol試劑盒說明用三氯甲烷—異丙醇—乙醇一步法提取總RNA，260 nm紫外分光光度計(jì)定量。取2 μg總RNA按MMLV試劑盒逆轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA作為PCR反應(yīng)模板。Nox1引物序列為sense:5'-ATAGCTACTGCCCACCCCAAGT-3'，antisense:5'-TTGAGTACCGCCGACAGCA-3'(99 bp);Nox4引物序列為sense:5'-GAACCTCAACTGCAGCCTGATC-3'，antisense:5'-CTTTGTCAACAATCTTCTTGTTCTC-3'(111 bp);β-actin引物序列為 sense:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'(241 bp)。antisense:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'。取5μL反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析處理，以目的基因表達(dá)量與β-actin表達(dá)量比值作為Nox1和Nox4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以xˉ±s表示，不同組間均數(shù)比較采用方差分析，兩變量相關(guān)性采用線性相關(guān)分析。P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.2 各組平滑肌Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表達(dá)的比較 心梗組Nox1 mRNA表達(dá)(0.68±0.05)顯著高于假手術(shù)組(0.44±0.06)(P ＜0.01)和心梗干預(yù)組(0.46 ±0.05)(P ＜0.05)，心梗干預(yù)組與假手術(shù)組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。心梗組Nox4 mRNA表達(dá)(0.67±0.06)顯著高于假手術(shù)組(0.46±0.08)(P ＜0.01)和心梗干預(yù)組(0.48 ±0.07)(P＜0.05)，心梗干預(yù)組與假手術(shù)組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見圖1。

圖1 Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表達(dá)的電泳圖

3 討論

隨著生活節(jié)奏的加快及飲食結(jié)構(gòu)的改變，急性心梗的發(fā)病率逐年上升，且呈現(xiàn)明顯的年輕化趨勢(shì)，而再灌注治療的廣泛開展使急性心?；颊叩木戎纬晒β拭黠@提高，但心梗后由于心肌細(xì)胞喪失、血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生異常而使神經(jīng)體液因素激活，機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生;此外，機(jī)體氧化應(yīng)激也可以導(dǎo)致血管功能和結(jié)構(gòu)改變，使血流動(dòng)力學(xué)進(jìn)一步惡化。故盡可能減少心肌壞死以保持心臟功能及應(yīng)用藥物抑制神經(jīng)體液因素激活和氧化應(yīng)激的發(fā)生成為當(dāng)今急性心梗的主要治療措施。

NADPH氧化酶包括Nox1-5和Duox1-2，統(tǒng)稱為Nox家族，血管平滑肌則主要表達(dá) Noxl和 Nox4［2］，稱為血管細(xì)胞NADPH氧化酶。黃湘等［3］發(fā)現(xiàn)心?；颊哐宓鞍籽趸a(chǎn)物、丙二醛、超氧化物歧化酶和氧化型低密度脂蛋白水平較健康組明顯升高，說明心梗后存在氧化應(yīng)激?；钚匝醍a(chǎn)生增多可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［4］、使NO滅活增加而致血管舒張功能下降、促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖［5］而致血管重構(gòu)，最終導(dǎo)致外周血管阻力增加。本研究發(fā)現(xiàn)，心梗組O－濃度顯著高于假手術(shù)組，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)

2 Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表達(dá)增加，且表達(dá)水平與濃度升高相關(guān)，提示心梗后平滑肌Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表達(dá)增加導(dǎo)致生成增加。Wingler等［6］研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌暴露于血管緊張素Ⅱ的時(shí)間愈長(zhǎng)，Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表達(dá)愈高。

他汀類藥物具有藥物多效性。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可通過抑制Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表達(dá)而減少產(chǎn)生。Maack等［7］對(duì)心衰患者的研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可減少生成，表明阿托伐他汀可抑制氧化應(yīng)激。另有研究提示，阿托伐他汀通過降低NADPH氧化酶的表達(dá)和活性［8，9］而減少生成。

［1］Babior BM，Lambeth JD，Nauseef W.The neutrophil NADPH oxidase［J］.Arch Biochem Biophys，2002，397(2):342-344.

［2］Tamara M，Paravicini，Lerna M，et al.Increased NADPH oxidase activity，gp91phox expression，and endothelium-dependent vasorelaxation during neointima formation［J］.Circ Res，2002，91(1):54-61.

［3］黃湘，譚家余，楊彩，等.老年急性心肌梗死與氧化應(yīng)激的關(guān)系研究［J］.西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2009，30(5):334-336.

［4］ Pollman MJ，Hall JL，Gibbons GH.Determinants of vascular smooth muscle cell apoptosis after balloon angioplasty injury.Influence of redox state and cell phenotype［J］.Circ Res，1999，84(1):113-121.

［5］Alvarez A，Sanz MJ.Reactive oxygen species mediate angiotensinⅡ-induced leukocyte-endothelial cell interactions in vivo［J］.Leukoc Biol，2001，70(2):199-206.

［6］Wingler K，Wunsch S，Kreutz R，et al.Upregulation of the vascular NAD(P)H-oxidase isoforms Nox1 and Nox4 by the renin-angiotensin system in vitro and in vivo［J］.Free Radic Biol Med，2001，31(11):1456-1464.

［7］Maack C，Kartes T，Kilter H，et al.Oxygen free radical release in human failing myocardium is associated with increased activity of rac1-GTPase and represents a target for statin treatment［J］.Circulation，2003，108(13):1567-1574.

［8］Wang CY，Liu PY，Liao JK.Pleiotropic effects of statin therapy:molecular mechanisms and clinical results［J］.Trends Mol Med，2008，14(1):37-44.

［9］Cangemi R，Loffredo L，Carnevale R，et al.Early decrease of oxidative stress by atorvastatin in hypercholesterolaemic patients:effect on circulating vitamin E［J］.European Heart Journal，2008，29(1):54-62.