張會珍，邢艷秋，章 萌，肖 冬，寇學俊，王 慧

(1山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，濟南250062;2濟南醫(yī)院;3山東大學齊魯醫(yī)院)

急性心肌梗死是常見的心血管疾病，早期溶栓和介入治療雖然開通了罪犯血管，一定程度上挽救了瀕死心肌，降低了發(fā)病率和病死率［1］，但再灌注的同時，隨著血運的恢復，某些受損的心肌細胞功能及結(jié)構(gòu)破壞反而加重，臨床上出現(xiàn)心律失常、心梗面積擴大等并發(fā)癥。缺血后適應作為一種新的治療策略，能夠有效減輕心肌再灌注損傷。2010年12月～2011年12月，本研究在缺血后適應的基礎上加用外源性磷酸肌酸，觀察其對進一步減輕缺血再灌注損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量260～290 g，購自山東大學實驗動物中心。小動物呼吸機、離心機、心電圖機、酶標儀、恒溫恒濕箱等由山東大學教育部、衛(wèi)生部心血管重構(gòu)與功能研究重點實驗室提供。伊文思藍購于美國Sigma公司，氯化三苯基四氮唑(TTC)購于美國Amresco公司。肌酸激酶(CK)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、髓過氧化物酶(MPO)試劑盒均購于南京建成生物工程有限公司。NF-κB酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購于上海藍基生物有限公司。磷酸肌酸購于意大利阿爾法韋士曼制藥公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備及分組 大鼠采用30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，氣管切開，連接小動物呼吸機進行機械通氣，分離肌層，沿胸骨左緣切開第3、4肋間，剪開心包，暴露心臟、左心耳及肺動脈圓錐，在左心耳下方2 mm、肺動脈圓錐左緣之間穿線進針，以冠狀靜脈為標志穿入7-0絲線用于結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)，同時將一內(nèi)徑1.5 mm的乳膠管置于結(jié)扎線和LAD之間，拉緊結(jié)扎線使乳膠管壓迫LAD，造成急性心肌缺血。缺血30 min后，拔出乳膠管，冠狀動脈再通，形成再灌注。實驗中以左室前壁出現(xiàn)紫紺及心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高為心肌缺血成功。冠狀動脈阻塞前經(jīng)尾靜脈注射肝素鈉300 U/kg抗凝。按抽簽法將大鼠隨機分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、缺血后適應組(IPost組)、磷酸肌酸后適應+缺血后適應組(Pcr+IPost組)各10只，均予心肌缺血30 min，再灌注120 min處理。Sham組冠狀動脈只穿線不結(jié)扎;I/R組缺血30 min后直接再灌注;IPost組再灌注前給予3次再灌注10 s/缺血10 s處理;Pcr+IPost組再灌注前5 min經(jīng)股靜脈緩慢注射磷酸肌酸200 mg/kg，再灌注前同時予3次再灌注10 s/缺血10 s處理。Sham組、I/R組、IPost組分別給予等量生理鹽水。

1.2.2 檢測方法 于再灌注2 h末抽取股靜脈血2 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清于-80℃保存待測。①血清CK、LDH、MPO活性測定:采用比色法測定CK、LDH、MPO的酶活力，按試劑盒說明書操作。②血清NF-κB檢測:采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，根據(jù)標準品制備蛋白曲線，檢測樣品的OD值，根據(jù)標準蛋白曲線測定樣品的蛋白濃度，具體操作參照試劑盒說明書。③心肌梗死面積的測定:實驗結(jié)束后，原位結(jié)扎冠狀動脈，經(jīng)頸靜脈注入1%的伊文思藍2～3 mL，待鞏膜、皮膚藍染后已將非缺血心肌染成藍色，從而顯示出缺血危險區(qū)心肌。10%氯化鉀處死動物，立即摘取心臟，生理鹽水沖掉殘余的染料后，去除大血管、心房及右心室，-20℃冷凍10 min，沿左心室長軸橫切為4～5片1～2 mm厚的心肌片，置1%TTC中，37℃孵育20 min，此時壞死區(qū)呈灰白色，非壞死心肌呈磚紅色，非缺血心肌呈藍紫色。最后將切片置于10%甲醛中固定15 min。將分離好的心肌組織分別稱質(zhì)量，心肌缺血危險區(qū)面積以缺血區(qū)心肌質(zhì)量/左室質(zhì)量來表示，心肌梗死面積以壞死區(qū)心肌質(zhì)量/缺血區(qū)心肌質(zhì)量來表示。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析;計量資料以ˉx±s表示，多組均數(shù)及組間兩兩比較分別采用單因素方差分析和最小顯著差異法(LSD法);兩指標間相關性分析采用Spearman相關分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清CK、LDH活性比較 見表1。

表1 各組血清CK、LDH活性比較(U/L，ˉx±s)

2.2 各組血清MPO、NF-κB比較 見表2。

表2 各組血清 MPO、NF-κB 比較(ˉx±s)

2.3 各組體質(zhì)量、左室質(zhì)量、心肌缺血及梗死面積比較 見表3。

表3 各組體質(zhì)量、左室質(zhì)量、心肌缺血及梗死面積比較(ˉx ±s)

2.4 相關性分析 Sperman相關分析結(jié)果顯示，NF-κB 與 MPO 呈正相關(P ＜0.05)。

3 討論

缺血后適應是指在較長心肌缺血后再灌注開始之前，立即給予3個周期的短暫停灌、復灌處理，即30 s再灌注、30 s再阻斷，反復3次，具有縮小心肌梗死面積、保護冠狀動脈內(nèi)皮功能及減輕缺血心肌炎癥反應等作用，與缺血預適應有相似的心臟保護作用，并將這種現(xiàn)象稱為“缺血后適應”［2］。大量動物實驗證實，缺血后適應能夠降低心肌梗死面積、改善左室功能，同時具有保護內(nèi)皮以及抗心肌細胞凋亡的作用。本研究采用3個周期的10 s缺血、10 s再灌注，結(jié)果也顯示缺血后適應可以明顯減少心肌酶釋放，降低心肌梗死面積，起到很好的心臟保護作用。近年來，缺血后適應逐漸被臨床應用。Zhao等［3，4］研究顯示，應用缺血后適應可以減少心肌酶的釋放、改善左室功能。磷酸肌酸是一個非常重要的能量底物，分子結(jié)構(gòu)特征中具有P-N型高能磷酸鍵，其分子兩端均為負電荷基團，能直接給細胞供應能量，具有3倍二磷酸果糖和1.5倍三磷酸腺苷(ATP)的能量水平，而且對細胞膜磷脂有很好的穩(wěn)定作用;同時磷酸肌酸在能量代謝中起到儲存和轉(zhuǎn)運ATP的雙重功能，而ATP是細胞代謝過程中最主要的能量源，故組織缺血時磷酸肌酸可能成為一種最主要最直接的供能物質(zhì)。目前，臨床上對磷酸肌酸的應用主要是慢性充血性心力衰竭、多種心臟外科手術的心臟停搏液中，在心肌急性缺血患者中也逐漸開始應用。國內(nèi)彭志堅等［5］對經(jīng)PCI的患者應用磷酸肌酸，結(jié)果顯示患者CK-MB峰值降低，ST段抬高總和回落百分比高于對照組;Prabhakar等［6］建立非體外循環(huán)的冠狀動脈旁路移植術小鼠動物模型，在外科手術前經(jīng)100 mg/kg磷酸肌酸預處理，結(jié)果顯示磷酸肌酸給藥組不僅提高了正常心肌組織內(nèi)磷酸肌酸/ATP的水平，也提高了缺血心肌內(nèi)的水平，減輕了代謝應激帶來的不良反應。以上研究均是在再灌注的基礎上應用磷酸肌酸，本研究首次采用磷酸肌酸后適應聯(lián)合缺血后適應的動物模型，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)用可進一步降低大鼠血清CK、LDH活性，減少心肌梗死面積，使其保護心臟作用明顯提高。

目前，關于磷酸肌酸對抗心肌缺血的機制仍不十分清楚。Yang等［7］研究顯示，在磷酸肌酸缺乏的情況下，肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子比較低，會發(fā)生自發(fā)性鈣離子釋放，造成鈣超負荷，對心肌細胞產(chǎn)生損傷，間接提示磷酸肌酸可能有減輕鈣超載的作用。研究證明，缺血再灌注損傷的主要機制除大量氧自由基的產(chǎn)生、鈣離子超負荷外，中性粒細胞的活化以及多種炎癥介質(zhì)及信號轉(zhuǎn)導分子也發(fā)揮了重要作用。MPO是中性粒細胞嗜天青顆粒中含量較高的酶，其活性高低可反映中性粒細胞的浸潤程度。NF-κB是一個關鍵的可誘導的轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)與重要生物過程有關的許多基因的表達，包括炎癥應激反應和細胞生存。正常情況下，NF-κB通過與NF-κB抑制劑和錨定蛋白重復結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以非活化的形式存在于細胞質(zhì)中;它能通過白介素-1、腫瘤壞死因子α、氧化應激等的激活，并向細胞核移位，從而激活目的基因轉(zhuǎn)錄，NF-κB活化的最終結(jié)果是促進炎癥基因的活化，而這些炎癥因子的升高又可以進一步促進NF-κB的活化，起到信號級聯(lián)放大作用，進而造成心肌的炎癥反應、細胞凋亡和壞死［9］。本研究顯示，缺血再灌注時血清MPO活性增加、NF-κB活化明顯上調(diào)，應用缺血后適應后，血清MPO與再灌注組比較明顯下降，NF-κB活化明顯降低，在缺血后適應的基礎上應用外源性磷酸肌酸，血清MPO進一步降低，NF-κB活化也進一步降低。提示磷酸肌酸有降低血清 MPO活性和抑制 NF-κB活化的作用。Spearman相關分析顯示，NF-κB與MPO呈顯著正相關，MPO隨著NF-κB的降低而明顯降低。因MPO是反映炎性浸潤的指標，而NF-κB是導致炎性因子釋放增加的始動因子，由此推測，磷酸肌酸聯(lián)合缺血后適應減輕大鼠缺血再灌注損傷的機制可能是通過抑制NF-κB活化途徑來抑制中性粒細胞聚集，從而抑制炎癥反應，保護心肌組織。

綜上所述，缺血后適應可以減輕缺血再灌注損傷，聯(lián)合磷酸肌酸后適應后，缺血再灌注損傷進一步減低，其機制可能與抑制NF-κB活化途徑介導的炎癥反應有關，兩者聯(lián)合起到了更好的保護作用。

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