鄒曉莉，杜繼衛(wèi)，梁 佳，魏 嘉，包翠芬

(遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧錦州121001)

缺血性腦病是指由于各種原因?qū)е碌哪X血管堵塞，引起腦功能障礙的相應(yīng)癥狀，嚴(yán)重危害人類健康。目前，該病的主要治療原則為擴(kuò)張血管、恢復(fù)正常血液供應(yīng)、縮小梗死面積、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗動(dòng)脈硬化等，而一氧化氮(NO)在維持腦血管張力和調(diào)節(jié)血壓方面起重要作用，其生成依賴于一氧化氮合酶(NOS)。2010年9月～2011年3月，本研究通過觀察大鼠局灶性腦缺血后腦組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)變化及人參皂苷Rg1對(duì)它的作用，探討Rg1治療腦缺血損傷的機(jī)制，為防治缺血性腦病的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，本實(shí)驗(yàn)室提供。藥品及試劑:人參皂苷Rg1，純度＞95%(吉林大學(xué)有機(jī)化學(xué)教研室提供);尼莫地平注射液(批號(hào)為071001，山西亞寶藥業(yè));兔抗大鼠iNOS、eNOS單克隆抗體(SANTA CRUZ公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性腦缺血模型的制備及分組10%水合氯醛腹腔麻醉，采用改良線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型［1］。線栓采用直徑0.23 mm魚線，長(zhǎng)度由頸外動(dòng)脈分叉處計(jì)約18.5 mm，假手術(shù)組插入深度小于15 mm。栓塞時(shí)間2 h。動(dòng)物清醒后參照Z(yǔ)ea Longa的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，采用單盲法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度判定。對(duì)不符合條件的大鼠予以剔除。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中剔除的大鼠均按嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件統(tǒng)一補(bǔ)充、分組。將SD大鼠隨機(jī)分為6組各10只:假手術(shù)組、單純?nèi)毖M、人參皂苷 Rg1 10、20、40 mg·kg－1處理組(Rg1 低、中、高劑量組)、尼莫地平1 mg·kg－1陽(yáng)性藥物處理組(control組)，每組10只。Rg1各組分別于術(shù)前5 d至取材前1 h腹腔注射人參皂苷Rg1，control組注射尼莫地平，其余各組分別注射等量生理鹽水，1次/d。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)iNOS、eNOS及圖像分析 缺血2 h后，各組大鼠10%水合氯醛麻醉，灌流固定，斷頭取腦，常規(guī)石蠟包埋。石蠟切片脫蠟至水，免疫組化二步法染色。iNOS和eNOS陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。采用CIAS-1000圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)每高倍視野iNOS、eNOS的陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件，數(shù)據(jù)均用ˉx±s表示，多組間差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析。P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

6組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及大腦皮層iNOS、eNOS表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較見表1。

3 討論

NO是一種新型生物信使分子，廣泛分布于生物體內(nèi)各組織中，特別是神經(jīng)組織中。NO是一種極不穩(wěn)定的生物自由基，分子量小，可快速透過血腦屏障擴(kuò)散;當(dāng)血管壓力突然升高時(shí)，NO可維持腦血流量相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)降低全身平均動(dòng)脈血壓，控制全身各種血管床的靜息張力，增加局部腦血流量，是血壓及腦血管張力的主要調(diào)節(jié)因子。研究表明，腦短暫缺血后NO含量顯著升高，但缺血3 h后下降，提示NO在局灶性腦缺血過程早期起重要作用［2］。NO的生成主要依賴于NOS。NOS有三個(gè)亞型，即神經(jīng)型(NOS1)、iNOS和eNOS。研究表明，正常情況下NOS的活性很低，但腦短暫缺血后iNOS表達(dá)顯著增多，eNOS無(wú)明顯改變。

表1 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及大腦皮層iNOS、eNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(ˉx ±s)

人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分之一，具有抗氧化、清除自由基等腦保護(hù)作用，但是其作用機(jī)制還不甚清楚［3，4］。研究人員采用 Griess法、3HL精氨酸轉(zhuǎn)化法分別研究大鼠大腦皮層細(xì)胞NO含量及NOS活性，結(jié)果顯示Rg1可顯著減少老年鼠大腦皮層NO含量和降低NOS活性。提示Rg1的抗衰老作用與其對(duì)NOS活性的抑制有關(guān)［5］。研究人員還發(fā)現(xiàn)，采用多巴胺誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡用以模擬阿爾茨海默病，細(xì)胞NO代謝產(chǎn)物水平顯著上升，預(yù)先應(yīng)用不同濃度的人參皂苷Rg1進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)水平顯著下降，并且濃度不同則調(diào)節(jié)效果不同，以濃度高組對(duì)含量的調(diào)節(jié)效果更為明顯［6］;李瑋等檢測(cè)β淀粉樣蛋白1-40誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞上清中NO濃度和iNOS表達(dá)情況，結(jié)果顯示Aβ模型組iNOS的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，應(yīng)用人參皂苷處理后THP-1細(xì)胞iNOS的表達(dá)和NO的產(chǎn)生明顯減少，隨著人參皂苷劑量的增大，THP-1細(xì)胞iNOS的表達(dá)和NO的產(chǎn)生明顯減少，且有劑量依賴性。提示人參皂苷可抑制THP-1細(xì)胞iNOS的表達(dá)，進(jìn)一步影響 NO 的產(chǎn)生［7］。尚吉文等［8］采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定海綿體NO含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去勢(shì)組陰莖海綿體NO濃度較對(duì)照組顯著降低，25 mg/kg人參皂苷組陰莖海綿體NO水平與去勢(shì)組接近，100 mg/kg人參皂苷組NO水平較去勢(shì)組明顯升高，與對(duì)照組接近。提示人參皂苷可以提高去勢(shì)大鼠陰莖海綿體組織NO水平，減少海綿體細(xì)胞凋亡，其對(duì)去勢(shì)大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡的抑制作用可能與其增加NO水平有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能缺損，而神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)有少量的iNOS、eNOS陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞;單純?nèi)毖M大鼠則出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)iNOS表達(dá)顯著增多，而eNOS表達(dá)無(wú)明顯改變;與單純?nèi)毖M比較，人參皂苷Rg1處理組神經(jīng)功能缺損癥狀得到顯著改善，神經(jīng)元iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，eNOS陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，以高劑量組改變最為顯著，提示人參皂苷Rg1可能通過下調(diào)神經(jīng)元iNOS、上調(diào)eNOS表達(dá)，調(diào)節(jié)NO水平，平衡腦血流量，維持血管張力，調(diào)節(jié)血壓，從而減輕缺氧所致的腦損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用，但是iNOS、eNOS在改善腦缺血方面如何發(fā)揮作用還有待深入研究。

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