孫 娜，季萬勝，劉俊衡，劉丹丹，高志星

(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261041)

胃癌是指起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，目前認(rèn)為胃癌的發(fā)生發(fā)展是多環(huán)節(jié)、多因素、多基因相互作用的結(jié)果。p53抑癌基因功能的失活在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。但最近的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，中國內(nèi)地胃癌 p53的突變率為30.6%［1］，提示部分胃癌的發(fā)生并沒有伴隨著p53的高突變率。研究顯示，p53的生物化學(xué)和生物學(xué)功能是可以通過p53異構(gòu)體和全長p53蛋白之間的相互作用來調(diào)節(jié)的。因此，研究p53異構(gòu)體在胃癌組織中的表達(dá)模式、異構(gòu)體對(duì)野生型p53功能的影響、特別是對(duì)p53下游分子表達(dá)水平的影響，有可能發(fā)現(xiàn)胃癌發(fā)生的新機(jī)制。我們采用PCR、免疫組化方法檢測了胃癌組織和癌旁胃組織中 p53異構(gòu)體、雙微基因2(MDM2)、同源性磷酸酶張力蛋白(PTEN)的表達(dá)情況，并探討其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及它們之間的相互關(guān)系，為胃癌的早期和臨床診斷提供更多的新思路和新方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年11月～2011年2月于濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科行胃癌根治術(shù)的30例胃癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本［包括胃癌組織和癌旁胃組織(距離正常胃癌組織5 cm)］。患者在術(shù)前均未接受任何放化療。男21例、女9例，年齡40～82歲、平均56歲。所取腫瘤組織均經(jīng)術(shù)后病理診斷為胃癌，所取癌旁胃組織均經(jīng)病理診斷未檢測到癌細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 PCR法檢測胃癌組織和癌旁胃組織中p53β、p53γ、Δ133p53、Δ133p53β、Δ133p53γ 的表達(dá)情況 應(yīng)用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取胃癌組織和癌旁胃組織的總RNA。胃組織RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):按照MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書及相關(guān)文獻(xiàn)操作，以試劑盒內(nèi)的Oligo-p(dT)18Primer為隨機(jī)引物，以M-MuLV RT酶為逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行體外逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。胃組織中 p53β、p53γ、Δ133p53、Δ133p53β、Δ133p53γ 五種 p53 異構(gòu)體PCR擴(kuò)增。總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、引物購自Sangon上海生工，BIO-RAD MyCyder PCR儀購自美國伯樂公司。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，將凝膠放入購自美國UVP的BioSpectrum AC凝膠成像系統(tǒng)掃描并拍照，并對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行判定。

1.2.2 免疫組化PV-9000兩步法檢測胃癌、癌旁組織中MDM2和PTEN的表達(dá)情況 標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色，病理確診，免疫組化步驟按說明書進(jìn)行。鼠抗人MDM2和PTEN單克隆抗體均購自北京中杉金橋，均為3 mL工作液。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，共計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，分別計(jì)算2種抗體的陽性細(xì)胞百分率。由2位以上病理醫(yī)生對(duì)免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行評(píng)價(jià)，依據(jù)鏡下切片中陽性染色細(xì)胞占瘤細(xì)胞總數(shù)的比例分為2級(jí)，－:無染色或染色陽性細(xì)胞數(shù)≤10%，+:染色陽性細(xì)胞數(shù)＞10%。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以百分比表示，比較行χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用Spearman’s等級(jí)相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p53異構(gòu)體在胃癌組織和癌旁胃組織中的表達(dá) 在30例胃癌組織和癌旁胃組織中均未檢測到p53γ、Δ133p53β、Δ133p53γ 這三種異構(gòu)體的 mRNA表達(dá)。Δ133p53的表達(dá)結(jié)果:在30例胃癌組織中有21例表達(dá)，占70.0%(21/30);在30例癌旁胃組織中有7例表達(dá)，占 23.3%(7/30);胃癌組織中Δ133p53表達(dá)高于癌旁胃組織(P ＜0.01)。p53β的表達(dá)結(jié)果:在30例胃癌組織中有8例表達(dá)，占26.7%(8/30);在30例癌旁胃組織中有21例表達(dá)，占70.0%(21/30)，胃癌組織p53β的表達(dá)低于癌旁胃組織(P ＜0.01)。

2.2 MDM2、PTEN在胃癌組織和癌旁胃組織中的表達(dá) MDM2的表達(dá)結(jié)果:在30例胃癌組織中有19例表達(dá)，占63.3%(19/30);在30例癌旁胃組織中有7例表達(dá)，占23.3%(7/30)，MDM2在胃癌組織中表達(dá)高于癌旁胃組織(P＜0.01)。PTEN的表達(dá)結(jié)果:在30例胃癌組織中有16例表達(dá)，占53.3%(16/30);在30例癌旁胃組織中有26例表達(dá)，占86.7%(26/30)，胃癌組織PTEN的表達(dá)低于癌旁胃組織(P ＜0.01)。

2.3 p53異構(gòu)體和MDM2、PTEN表達(dá)的相關(guān)性分析 Spearman’s相關(guān)性分析顯示，Δ133p53和MDM2，p53β和PTEN在胃癌中表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.408，P=0.025;r=0.413，P=0.023);Δ133p53和PTEN，p53β和MDM2在胃癌中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= －0.467，P=0.009;r= －0.480，P=0.007)。見表 1、2。

表1 胃癌組織中Δ133p53與MDM2、PTEN相關(guān)性分析

表2 胃癌組織中p53β與MDM2、PTEN相關(guān)性分析

3 討論

抑癌基因p53的功能失活在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，p53異構(gòu)體的發(fā)現(xiàn)為胃癌發(fā)生機(jī)制的研究提供了新方向。p53異構(gòu)體的活性主要通過改變內(nèi)部啟動(dòng)子的活性、p53 mRNA的剪接及p53異構(gòu)體的亞細(xì)胞定位來實(shí)現(xiàn)［2］。最近研究發(fā)現(xiàn)，人類p53異構(gòu)體(Δ133p53和p53β)能夠組成一內(nèi)源性的調(diào)節(jié)機(jī)制，并且能夠作用于p53介導(dǎo)的復(fù)制細(xì)胞的衰老。在人類正常成纖維細(xì)胞中，p53β的誘導(dǎo)生成和Δ133p53的減少與復(fù)制細(xì)胞的衰老有關(guān)，這種衰老與癌基因所致的衰老不同。在結(jié)腸腺癌中可以觀察到Δ133p53表達(dá)水平升高和p53β表達(dá)水平下降，這可能是在從腺瘤到癌的進(jìn)展過程中，逃脫了衰老障礙的一種信號(hào)［3］，即天然存在的p53異構(gòu)體為復(fù)制細(xì)胞的衰老進(jìn)行生理學(xué)上的調(diào)節(jié)。隨著體內(nèi)試驗(yàn)證據(jù)表明，p53異構(gòu)體特異性表達(dá)的建立和缺失能夠分別誘導(dǎo)和逃脫衰老狀態(tài)，如果打破這種衰老機(jī)制則可以誘導(dǎo)腫瘤的生成。本研究顯示，在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)Δ133p53 mRNA水平增高，p53βmRNA水平降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

p53基因是人類發(fā)現(xiàn)最早的抑癌基因，MDM2高表達(dá)呈現(xiàn)癌基因的功能，其表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞核內(nèi)可以與野生型和突變型p53結(jié)合使其功能失活。p53和MDM2之間存在著自我反饋環(huán)，該反饋環(huán)使細(xì)胞內(nèi)的MDM2/p53比率保持恒定［4］。通過研究p53-MDM2自我反饋環(huán)，發(fā)現(xiàn)MDM2與p53結(jié)合后可使p53泛素化，泛素化的p53被蛋白酶體降解而直接被清除［5，6］。正確的亞細(xì)胞定位對(duì)于p53的活性十分重要，p53被激活后進(jìn)人核內(nèi)，激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄，之后回到胞質(zhì)中被降解。最近發(fā)現(xiàn)，p53向核外轉(zhuǎn)運(yùn)可能以MDM2依賴性的方式進(jìn)行控制，因?yàn)镸DM2中含有的NLS和NES保證了MDM2可以穿梭于胞核與胞質(zhì)之間，核內(nèi)MDM2將p53捕獲，通過MDM2上的NLS將兩種蛋白質(zhì)運(yùn)出細(xì)胞核。如果細(xì)胞將MDM2修飾或改變核輸出裝置使MDM2滯留在核，p53將不被降解。PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因，該基因的編碼產(chǎn)物能夠使被PI3K激活的細(xì)胞內(nèi)第二信使PIP3去磷酸化，從而影響細(xì)胞內(nèi) PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［7，8］。MDM2 是一原癌基因，最近研究表明，PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以激活細(xì)胞的磷酸化過程，從而導(dǎo)致MDM2癌蛋白由胞質(zhì)進(jìn)入胞核，而PTEN可以通過對(duì)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，阻止MDM2癌蛋白由胞質(zhì)進(jìn)入胞核，從而加速該蛋白的降解［7，9］。由此PTEN 參與到p53-MDM2自我反饋環(huán)中，形成了PTEN-MDM2-p53網(wǎng)絡(luò)環(huán)路，影響著腫瘤的生成。

本研究結(jié)果顯示，在胃癌組織和癌旁胃組織中p53異構(gòu)體的表達(dá)情況不同，能夠檢測到Δ133p53、p53β 表達(dá)，未檢測到 p53γ、Δ133p53β、Δ133p53γ 的表達(dá)。Δ133p53、MDM2在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁胃組織，p53β、PTEN在癌旁胃組織中的表達(dá)高于胃癌組織。相關(guān)性分析顯示，Δ133p53和MDM2，p53β和 PTEN在胃癌中的表達(dá)均呈正相關(guān);Δ133p53和PTEN，p53β和MDM2在胃癌中的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。由此推測，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，Δ133p53、p53β通過調(diào)節(jié) p53活性，并以 p53為中介，影響了PTEN-MDM2-p53網(wǎng)絡(luò)環(huán)路中PTEN、MDM2蛋白的表達(dá)，并提示 p53異構(gòu)體中的Δ133p53可能是通過降低PTEN、p53的抑癌蛋白表達(dá)及提高M(jìn)DM2促癌蛋白的表達(dá)而發(fā)揮促癌作用的;而p53β可能是通過提高PTEN、p53的抑癌蛋白表達(dá)及降低MDM2促癌蛋白的表達(dá)，調(diào)控PTENMDM2-p53網(wǎng)絡(luò)環(huán)路從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生。

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