李芳芳，張紅梅，張小茜，張廣學(xué)，曲梅花，季萬勝

(1濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊261041;2濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用藥理學(xué)實驗室)

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，全世界死于胃癌的人數(shù)每年超過65萬［1］。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，涉及到多種癌基因激活、抑癌基因的失活以及由此引起的細(xì)胞生物學(xué)行為改變等許多方面，但其確切的發(fā)病學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。p53是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。在過去25年中，腫瘤抑制蛋白p53被認(rèn)為是TP53的惟一產(chǎn)物，但從2002年開始，許多研究發(fā)現(xiàn)，至少存在9種p53選擇性剪接異構(gòu)體，并證實它們具有調(diào)節(jié)p53功能的作用。不同的p53異構(gòu)體作為一種轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)p53的轉(zhuǎn)錄活性，引發(fā)一系列對p53活性產(chǎn)生重要作用的生物學(xué)反應(yīng)，共同參與細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生命過程的調(diào)節(jié)，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要作用。因此，研究不同p53異構(gòu)體特有的生物學(xué)功能，對深入認(rèn)識細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)及腫瘤發(fā)生的機(jī)理有重要作用。目前，有關(guān)p53剪接異構(gòu)體在人類組織中表達(dá)情況的研究甚少，其表達(dá)范圍和意義尚不清楚。本研究采用巢式逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(NT-PCR)檢測p53選擇性剪接異構(gòu)體Δ133p53 mRNA在胃癌、慢性萎縮性胃炎和慢性淺表性胃炎中的表達(dá)變化，初步探討其表達(dá)規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2010年11月～2011年8月80例胃癌患者的手術(shù)切除及胃鏡下活檢組織標(biāo)本，患者男56例、女24例，年齡23～81歲。其中胃癌(GC)30例、慢性萎縮性胃炎(CAG)30例、慢性淺表性胃炎(CSG)20例，胃癌的診斷符合2002年國際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn);按組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，其中高分化胃癌4例、中分化胃癌18例、低分化胃癌8例?；颊邿o長期糖皮質(zhì)激素及非甾體抗炎藥服用史，術(shù)前均未接受任何放化療。

1.2 方法

1.2.1 胃組織RNA提取 應(yīng)用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取胃組織的總RNA。詳細(xì)步驟如下:剪取胃組織約0.05 g，加入1 ml Trizol，用勻漿器進(jìn)行勻漿處理后轉(zhuǎn)移至EP管中(置于冰上操作)。將勻漿液室溫放置10 min，使核蛋白與核酸完全分離。加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩30 s，室溫放置3 min。12 000 r/min，4℃離心10 min。吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中，加入1/2體積無水乙醇混勻。將UNIQ-10柱放入收集試管，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮液全部加至收集試管中，靜置2 min，12 000 r/min，離心 3 min，倒掉收集試管中廢液。將UNIQ-10柱放回收集試管中，加入 500 μL RPE Solution，靜置 2 min，10 000 r/min，離心30 s，倒掉收集試管中廢液。重復(fù)此步驟一次。將UNIQ-10柱放回收集試管中，10 000 r/min，離心2 min。將UNIQ-10柱放入干凈的1.5 mL EP管中，在吸附膜中央加入30μL DEPC-treated ddH2O，靜置 5 min，12 000 r/min，離心 2 min，所得到的液體即為RNA，置于－150℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 NT-PCR檢測 Δ133p53 按照 MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書及相關(guān)文獻(xiàn)操作，以試劑盒內(nèi)的Oligo-p(dT)18 Primer為隨機(jī)引物，以MMuLV RT酶為逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行體外逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在冰浴的干凈EP管中加入如下反應(yīng)混合物:總RNA 2 μL，Oligo-p(dT)18 Primer 1 μL，RNase-free water 9 μL，總體積12μL。輕輕混勻后離心5 s。反應(yīng)混合物在PCR儀中于70℃水浴5 min，冰浴30 s，然后離心5 s。將EP管冰浴，再加入如下組分:5×Reaction Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(20 U/μL)1 μL dNTP Mix(10 mmol/L)2 μL，總體積 7 μL，輕輕混勻后離心5 min。反應(yīng)混合物在PCR儀中于70℃水浴5 min，加入1 μL M-MuLV RT(20 U/μL)，終體積為20μL。反應(yīng)混合物在PCR儀中于70℃水浴60 min。混合物在PCR儀中于70℃加熱10 min結(jié)束反應(yīng)，合成的cDNA即作為PCR反應(yīng)的模板，－20℃分裝保存?zhèn)溆?。測量Δ133p53的mRNA表達(dá)情況所需引物見表1［1］，PCR反應(yīng)條件為:94℃變性1 min，58 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，35 個循環(huán)。反應(yīng)體系為:Sterilized ddH2O 24μL、10×PCR Buffer 5 μL、2 mmol/L dNTP 5 μL、上游引物(10 μmol/L)5 μL、下游引物(10 μmol/L)5 μL、25 mmol/L MgCl23 μL、Taq DNA 多聚酶 1 μL、模板DNA 2μL，總體積50μL。最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果放入BiospectrumAC凝膠成像系統(tǒng)掃描并拍照。

表1 Δ133p53的引物序列和目的基因長度

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以百分比表示，比較進(jìn)行χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

Δ133p53分別表達(dá)在 21例(70.0%)胃癌、15例(50.0%)慢性萎縮性胃炎、5 例(25.0%)慢性淺表性胃炎組織中，提示Δ133p53在胃癌、慢性萎縮性胃炎和慢性淺表性胃炎組織中的表達(dá)呈逐漸明顯下降趨勢(P均＜0.05)。見圖1。8例胃低分化癌中，7例表達(dá)Δ133p53;18例胃中分化癌中，14例表達(dá)Δ133p53;4例高分化癌中，1例表達(dá)Δ133p53。

3 討論

圖1 Δ133p53電泳結(jié)果

p53是最早確認(rèn)的腫瘤抑制基因，超過半數(shù)的腫瘤組織表達(dá)突變p53蛋白，突變p53蛋白失去對細(xì)胞周期的控制，基因變異得以積累，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。但最近的研究表明，中國內(nèi)地胃癌p53突變率為30.6%［2］，可見胃癌的發(fā)生并沒有伴隨著p53的高突變率，說明胃癌的發(fā)生可能存在其他的機(jī)制導(dǎo)致了p53基因的失活或影響了其轉(zhuǎn)錄活性。

選擇性剪接是指從一個mRNA前體通過選擇不同的剪接位點(diǎn)組合產(chǎn)生不同的mRNA剪接變異體的過程，經(jīng)常發(fā)生在隱蔽的剪接位點(diǎn)，致使外顯子遺漏和(或)內(nèi)含子保留。許多研究證實，選擇性剪接與維持細(xì)胞正常生理功能、組織的發(fā)育調(diào)節(jié)以及人類疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系［3，4］。人類p53基因位于17P13.1，全長19 200 bp，含有11個外顯子和10個內(nèi)含子。以往的研究認(rèn)為p53基因結(jié)構(gòu)簡單，僅包含1個啟動子和3種 mRNA剪接異構(gòu)體［5］。隨著研究的深入，認(rèn)識到人類p53基因和其家族基因p63、p73一樣含有2個選擇性啟動子［6］。到目前為止，人類p53基因至少編碼9種剪接異構(gòu)體，它們分別為 p53、p53β、p53γ、Δ133p53、Δ133p53β 和Δ133p53γ(通過位于內(nèi)含子4上的啟動子和對內(nèi)含子9的選擇性剪接)以及 Δ40p53、Δ40p53β和Δ40p53γ(通過對內(nèi)含子2的選擇性剪接或翻譯過程中的選擇性啟動［6，7］)。

研究已發(fā)現(xiàn)，p53異構(gòu)體在乳腺腫瘤、急性髓系白血病、頭頸部腫瘤、黑色素瘤、卵巢腫瘤、腎細(xì)胞癌及結(jié)腸腫瘤中呈現(xiàn)差異表達(dá)的特征，特定異構(gòu)體的表達(dá)與腎細(xì)胞癌、頭頸部腫瘤和卵巢腫瘤的發(fā)生相關(guān)［8～11］;但p53異構(gòu)體與胃癌之間關(guān)系的相關(guān)研究國內(nèi)外尚無報道。

在本試驗中，應(yīng)用NT-PCR技術(shù)檢測p53剪接異構(gòu)體Δ133p53，結(jié)果顯示隨著胃癌惡性程度的升高，Δ133p53的表達(dá)呈上升趨勢。由于樣本例數(shù)較少，胃癌分化類型之間的比較顯示無統(tǒng)計學(xué)意義。通過此現(xiàn)象我們推測，Δ133p53的表達(dá)在人慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃高分化癌、胃中分化癌、胃低分化癌組織中呈逐漸上升趨勢，即隨著胃癌惡性程度的升高，Δ133p53的表達(dá)呈上升趨勢，進(jìn)而推測Δ133p53可能為促癌因子，為今后這方面的科研探索提供了一個很有意義的思路和推測。

總之，p53剪接異構(gòu)體Δ133p53與胃癌的發(fā)生有一定關(guān)系。目前有關(guān)p53剪接異構(gòu)體與胃癌的研究才剛剛起步，其作用機(jī)制尚不清楚，還需大量的工作去做進(jìn)一步探討。這對深入認(rèn)識胃癌發(fā)生的機(jī)理有重要意義，并為胃癌的早期診斷和治療提供重要依據(jù)。

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