龍璐璐，許文林，沈慧玲，冷加燕

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212002)

自噬是細(xì)胞的一種可調(diào)控的溶酶體降解過程，通過降解長壽命蛋白、部分細(xì)胞器等以實現(xiàn)自身代謝需要和細(xì)胞器的更新［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的自噬和自噬性細(xì)胞死亡在一些治療條件下可以被激活［2，3］，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療中的作用越來越受到關(guān)注。Y-box結(jié)合蛋白-1(YB-1)是Y-box結(jié)合蛋白家族成員之一，參與基因的轉(zhuǎn)錄翻譯、DNA修復(fù)、細(xì)胞增殖與再生、藥物的耐藥和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等多種生物過程。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)小劑量的As2O3可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，YB-1可以抑制As2O3誘導(dǎo)的自噬［4］。為進(jìn)一步探討YB-1抑制自噬的分子機(jī)制，2011年3月～2011年12月，本研究應(yīng)用As2O3模擬細(xì)胞損傷模型，利用 RNA干擾(RNAi)技術(shù)部分沉默或過表達(dá)人胃癌BGC-823細(xì)胞中的YB-1基因，觀察 As2O3在BGC-823細(xì)胞自噬中的作用，并初步闡明其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌BGC-823細(xì)胞由本實驗室保存。As2O3購自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)。HA14-1購自美國Calbiochem公司。單丹磺酰戊二胺(MDC)購自Sigma公司。胎牛血清購自杭州四季青，人DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司。RNA提取試劑盒購自上海生工公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒、蛋白提取試劑盒購自TaKaRa公司。HRP標(biāo)記的羊抗兔、鼠二抗均購自北京康為世紀(jì)生物公司。兔抗人YB-1、Bcl-2、Beclin1、LC3 抗體，鼠抗人 P62、actin 抗體，均購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 人胃癌BGC-823細(xì)胞以1×106接種在培養(yǎng)瓶中，用含有10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。按照實驗設(shè)計分組:空白對照(control)組、空質(zhì)粒(HK)組、干擾質(zhì)粒(siYB-1)組、空病毒(AdGFP)組、pAd1Easy/YB1腺病毒表達(dá)載體(AdYB-1)組，使用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后24 h，鑒定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 HA14-1的制備及分組 HA14-1是Bcl-2的小分子配體，可與Bcl-2蛋白結(jié)合而降低其生物學(xué)活性。將該化合物以104μmol/L的濃度溶解于DMSO中，－70℃避光保存。根據(jù)實驗設(shè)計將BGC-823細(xì)胞分為三組:AdGFP組、AdYB-1組、HA14-1組(AdYB-1轉(zhuǎn)染后加入50μmol/L的HA14-1作用4 h)。

1.2.3 qRT-PCR檢測Bcl-2和Beclin1的基因表達(dá)

Trizol法提取各組BGC-823細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，美國BIO-RAD熒光定量PCR儀擴(kuò)增分析。Bcl-2基因上游引物:5'-GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3'，下 游 引 物:5'-GGTGCCGGTTCAGGTACTCA-3'。Beclin1基因上游引物:5'-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3'，下游引物:5'-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3'。β-actin為內(nèi)參，上游引物:5'-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC-3'，下游引物:5'-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3'。

1.2.4 MDC染色觀察細(xì)胞自噬泡的聚集 BGC-823細(xì)胞以每孔5×104接種于24孔板中，按照實驗分組。轉(zhuǎn)染24 h后加入4μmol/L As2O3處理24 h，4%多聚甲醛固定，50μmol/L的MDC孵育。激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬空泡的積聚。

1.2.5 Western blot檢測 Beclin1、P62、LC3 蛋白表達(dá) 收集各組 BGC-823細(xì)胞，RIPA裂解細(xì)胞，12 000 r/min，4℃離心，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。1%BSA封閉 2 h。YB-1抗體(1∶200)、Bcl-2 抗 體 (1 ∶500)、Beclin1 抗 體(1∶800)、P62 抗體(1∶300)、LC3 抗體(1∶3 000)4℃孵育過夜。HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶5 000)、羊抗鼠二抗(1∶5 000)孵育1 h。凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。以β-actin為內(nèi)參，以靶蛋白積分光密度(IOD)值與β-actin IOD值的比值反映靶蛋白相對水平。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)均用xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異比較采用q檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組YB-1的表達(dá) 與HK組和AdGFP組相比，siYB-1組YB-1蛋白表達(dá)明顯降低，AdYB-1組YB-1蛋白表達(dá)明顯升高。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染siYB-1和AdYB-1后YB-1的表達(dá)

2.2 各組 Bcl-2、Beclin1基因表達(dá)水平比較 與AdGFP組和HK組相比，AdYB-1組Bcl-2/β-actin基因相對表達(dá)量明顯增加(P＜0.05)，siYB-1組Bcl-2/β-actin表達(dá)降低(P＜0.05)。見圖2。各轉(zhuǎn)染組Beclin1/β-actin基因相對表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖2 qRT-PCR檢測Bcl-2/β-actin基因相對表達(dá)量

2.3 各組 Bcl-2、Beclin1蛋白表達(dá)水平比較 與AdGFP組和HK組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)在AdYB-1組升高，在siYB-1組降低;而 Beclin1蛋白表達(dá)在AdYB-1組明顯降低，siYB-1組顯著升高(P均 ＜0.01)。見圖3A。自噬水平檢測顯示，AdYB-1組P62蛋白聚集增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ降低(P ＜0.01)，抑制了自噬;應(yīng)用siYB-1干擾YB-1表達(dá)后，促進(jìn)了自噬的發(fā)生。

2.4 HA14-1對YB-1抑制自噬的影響 MDC染色結(jié)果顯示，與AdGFP組相比，AdYB-1組自噬泡聚集減少，而轉(zhuǎn)染AdYB-1后加入HA14-1處理后，自噬泡重新聚集。Western blot檢測結(jié)果顯示，與AdGFP組相比，AdYB-1組Beclin1蛋白表達(dá)降低，P62蛋白聚集增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ減少，自噬水平降低。轉(zhuǎn)染AdYB-1并加入HA14-1后，Beclin1蛋白恢復(fù)表達(dá)，P62蛋白降解增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ重新升高。見圖3B。提示HA14-1可能通過抑制Bcl-2的活性、上調(diào)Beclin1的表達(dá)影響YB-1對As2O3誘導(dǎo)的BGC-823細(xì)胞自噬的活性。

圖3 Western blot檢測蛋白結(jié)果

3 討論

自噬廣泛存在于真核細(xì)胞的病理生理過程中，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)細(xì)胞生存方面起重要作用［5］。近年研究發(fā)現(xiàn)As2O3可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬及自噬性細(xì)胞死亡。本實驗室的前期研究也發(fā)現(xiàn)As2O3可誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞自噬的發(fā)生。

YB-1是腫瘤細(xì)胞生存的一個正調(diào)控因子。YB-1的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞抗凋亡及產(chǎn)生耐藥等［6］。但是有關(guān)YB-1抑制自噬的研究并未見報道，本實驗室的前期研究首次揭示YB-1可以抑制As2O3誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬。提示YB-1作為一個癌基因和抗細(xì)胞死亡的分子，在腫瘤的進(jìn)程中可能參與更廣泛的病理過程，其抑制As2O3誘導(dǎo)的自噬的功能可能為腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療提供新的理論依據(jù)。本實驗采用RNAi技術(shù)部分沉默或過表達(dá)YB-1，探討YB-1抑制As2O3誘導(dǎo)的BGC-823細(xì)胞自噬的分子機(jī)制。

Beclin1是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬過程的關(guān)鍵基因之一，其機(jī)制主要是與Ⅲ型PI3K形成復(fù)合物，參與募集胞質(zhì)中含有FYVE或PX基序的蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)前自噬體的形成及自噬蛋白在自噬體膜上的定位過程［7］。Pattingre等［8］研究表明，抗凋亡蛋白 Bcl-2能夠與Beclin1形成復(fù)合物，抑制Beclin1依賴的自噬。本研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2與YB-1抑制As2O3誘導(dǎo)的BGC-823細(xì)胞自噬相關(guān)，并且加用Bcl-2抑制劑HA14-1使Bcl-2失活后，Beclin1表達(dá)下調(diào)，減弱了YB-1對自噬的抑制作用。提示YB-1對As2O3誘導(dǎo)的BGC-823細(xì)胞自噬的抑制作用可能是通過上調(diào)了Bcl-2的表達(dá)，從而抑制Beclin1而實現(xiàn)的。

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