岳 鑫 岳 磊 王 麗 (解放軍第208醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 30062)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，不論是發(fā)病率還是死亡率均占泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位。近年來(lái)膀胱癌的發(fā)病率有上升趨勢(shì)，多數(shù)為移行上皮細(xì)胞癌。膀胱移行細(xì)胞癌的特點(diǎn)是發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、治療復(fù)雜。低劑量絲裂霉素(MMC)化療不但可提高療效，且減輕毒副作用，與常規(guī)化療劑量方案比較，其增效減毒作用顯著。本研究以生物降解高分子材料丙交酯己內(nèi)酯共聚物(PLCL，LA/CL 80∶20，SFDA認(rèn)證)為載體制備了新劑型，為驗(yàn)證納米纖維劑型MMC對(duì)膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)活性，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株T24購(gòu)自武漢博士德公司。

1.1.2 可生物降解MMC納米纖維片 采用電紡絲技術(shù)制備載有MMC生物降解丙交酯/己內(nèi)酯共聚物納米纖維。藥物擔(dān)載濃度為5%(質(zhì)量百分比濃度)。MMC購(gòu)于浙江海正藥業(yè)股份有限公司(純度＞99%)。

1.2 方法

1.2.1 人工計(jì)數(shù)法 所選T24細(xì)胞以4×105細(xì)胞/ml制備細(xì)胞懸液;然后選用24孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞。將擔(dān)載MMC的可生物降解載藥納米紗布剪成不同質(zhì)量的小片，分別為2、4、8 mg，加入不同質(zhì)量的小片于T24細(xì)胞的培養(yǎng)板孔中，日消化細(xì)胞3復(fù)孔，消化時(shí)間為第1、2、3、4、5 天，臺(tái)盼藍(lán)染色后，使用光學(xué)纖維鏡及血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)受試細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 四唑鹽(MTT)比色法 選用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的T24細(xì)胞，用0.25%胰酶消化為單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至5×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h后，加入不同重量的擔(dān)載MMC的納米纖維(質(zhì)量分別為1、2、4、8 mg)，同時(shí)需設(shè)對(duì)照組。每組做3復(fù)孔。培養(yǎng)12、24、36、48 h和72 h后取出置96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在每孔內(nèi)加入 20 μl MTT(濃度20 mg/ml)，放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng);4 h過(guò)后，將培養(yǎng)板取出，將細(xì)胞內(nèi)MTT與線粒體酶發(fā)生反應(yīng)后形成的藍(lán)紫色結(jié)晶物于倒置光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察;上清液棄掉，每孔內(nèi)加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，水平搖床振蕩10～15 min;用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度(OD)值。細(xì)胞存活率公式:給藥組OD/對(duì)照組OD×100%。

1.2.3 Western印跡檢測(cè)各種蛋白表達(dá) T24細(xì)胞鋪板:取傳代后狀態(tài)好的細(xì)胞接種于直徑6 cm培養(yǎng)皿中，將其放于5%CO2，37℃的飽和濕度培養(yǎng)箱，時(shí)間為24 h。藥物處理培養(yǎng)細(xì)胞:吸除培養(yǎng)液后，加入不同重量的(2、4 mg和8 mg)擔(dān)載MMC的納米纖維，持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。刮取不同質(zhì)量組別細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行提取并定量后，對(duì)(1)細(xì)胞周期素依賴激酶(cyclin dependent kinase4，CDK4);(2)細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑-1(WAF1/p21);(3)細(xì)胞周期蛋白(cyclin D1)的含量變化進(jìn)行研究，Western印跡檢測(cè)后，用底片掃描儀掃描X光膠片，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行解讀，并通過(guò)Bandscan軟件進(jìn)行密度掃描。對(duì)照抗體見(jiàn)表1。

表1 抗體稀釋濃度表

2 結(jié) 果

2.1 擔(dān)載MMC的納米纖維片對(duì)T24細(xì)胞增殖的抑制作用細(xì)胞計(jì)數(shù)法與空白對(duì)照組相比，2、4、8 mg的擔(dān)載MMC的納米纖維在24 h后都顯著地降低了T24細(xì)胞數(shù)目。以72 h為例，由525×104個(gè)/ml分別降低為470×104個(gè)/ml(2 mg)、425×104個(gè)/ml(4 mg)和350×104個(gè)/ml(8 mg)。見(jiàn)圖1。

圖1 擔(dān)載MMC的納米纖維片對(duì)T24細(xì)胞數(shù)目的影響

2.2 MTT比色法檢測(cè)擔(dān)載MMC的納米纖維片對(duì)T24細(xì)胞增殖的抑制作用 經(jīng)擔(dān)載MMC的納米纖維片處理3 d的T24細(xì)胞OD值顯著下調(diào)，并以劑量-時(shí)間依賴的方式，存在顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 擔(dān)載MMC的納米纖維片對(duì)T24細(xì)胞增殖的抑制作用

2.3 擔(dān)載MMC的納米纖維片對(duì)T24細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響

擔(dān)載MMC的納米纖維以劑量依賴方式顯著升高了WAF1/p21的表達(dá)，而使CDK4和cyclin D1的表達(dá)降低。見(jiàn)圖3。

圖3 擔(dān)載MMC的可生物降解載藥納米紗布片對(duì)T24細(xì)胞WAF-1/p21、Cyclin D1和Cdk4含量的影響

3 討論

MTT比色分析法不僅操作簡(jiǎn)單，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性高，故而可作為了解藥物與腫瘤細(xì)胞之間作用機(jī)制研究的手段之一。本文通過(guò)對(duì)比擔(dān)載MMC的可生物降解載藥納米纖維對(duì)照組和藥敏組腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，可以檢測(cè)出藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生存率所產(chǎn)生的影響。T24細(xì)胞作為多種實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的腫瘤細(xì)胞樣本，用途廣泛，來(lái)源于老年白人女性，20 h為其細(xì)胞倍增時(shí)間〔1〕，但作為擔(dān)載MMC納米纖維的受試細(xì)胞(膀胱癌T24細(xì)胞)，研究者們未曾涉足。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，擔(dān)載MMC的納米纖維片可以顯著地抑制T24細(xì)胞增殖，并且為時(shí)間-濃度依賴性方式。

p53在轉(zhuǎn)錄水平上能夠激活WAF-1/p21。在由p53調(diào)控的因DNA損傷而使細(xì)胞停頓于G1期的反應(yīng)中，p21發(fā)揮效應(yīng)基因的作用;p21可結(jié)合和抑制增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，進(jìn)而抑制DNA的復(fù)制及DNA多聚酶，使損傷的DNA在復(fù)制前修復(fù)功能。在G1期發(fā)揮調(diào)控作用的主要是cyclin D及其結(jié)合分子CDK4 和 CDK6〔2～4〕。cyclin D1-CDK4-pRb 通路在細(xì)胞由 G1期躍遷至S期起到關(guān)鍵作用。cyclin D1和CDK4被證實(shí)在腫瘤的發(fā)生中起重要作用，并被認(rèn)為可能是判斷腫瘤預(yù)后的重要因子和治療靶點(diǎn)〔5，6〕。

本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)研究領(lǐng)域是檢測(cè)下述各項(xiàng)指標(biāo):WAF-1/p21，CDK4，cyclin D1。結(jié)果表明:擔(dān)載MMC的可生物降解載藥納米紗布片以劑量依賴的方式顯著地提高WAFl/p21表達(dá)，而使CDK4及cyclin D1蛋白表達(dá)下降。結(jié)合本研究考慮，擔(dān)載MMC的納米纖維片可使G1期阻滯，其原因可能是其上調(diào)了WAF1/p21的表達(dá)，下調(diào)了CDK4和cyclin D1的表達(dá)。

1 魏樹禮，李志芳，高智慧，等.絲裂霉素C白蛋白微球的研究〔J〕.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1990;22(3):201.

2 Liang CM，Tai MC，Chang YH，et al.Glucosamine inhibits epidermal growth factor-induced proliferation and cell-cycle progression in retinal pigment epithelial cells〔J〕.Mol Vis，2010;16:2559-71.

3 Peng J，Zhu Y，Milton JT，et al.Identification of multiple cyclin subunits of human P-TEFb〔J〕.Genes Dev，1998;12(5):755-62.

4 Rickert P，Seghezzi W，Shanahan F，et al.Cyclin C/CD8 is a novel CTD kinase associated with RNA polymerase〔J〕.Oncogene，1996;12(2):2631-40.

5 Jia X，Liu B，Shi X，et al.Roles of the ERK，JNK/AP-1/cyclin D1-CDK4 pathway in silica-induced cell cycle changes in human embryo lung fibroblast cells〔J〕.Cell Biol Int，2011;35(7):697-704.

6 Burkhart DL，Wirt SE，Zmoos AF，et al.Tandem E2F binding sites in the promoter of the p107 cell cycle regulator control p107 expression and its cellular functions〔J〕.PLoS Genet，2010;6(6):100-3.