饒 娜 楊國(guó)棟 安 芳 王書(shū)華 (河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000)

金蓮花是毛茛科植物金蓮花的干燥花及花蕾，有清熱解毒，消腫明目的功效，臨床上主要用于上呼吸道感染、扁桃體炎〔1〕等。葒草苷和牡荊苷在金蓮花黃酮中含量較高〔2〕，金蓮花總黃酮及其單體葒草苷和牡荊苷具有體外抗氧化〔3，4〕、抗腫瘤〔5～7〕等作用，藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，葒草苷、牡荊苷廣泛分布于動(dòng)物體內(nèi)的各組織，腎臟中濃度最高〔8，9〕。從中醫(yī)學(xué)角度來(lái)說(shuō)，藥物入腎，對(duì)于提高機(jī)體免疫力，抗衰老、抗腫瘤等提供了一個(gè)有力的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 葒草苷和牡荊苷(河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心自制，經(jīng)1H-NMR和HPLC鑒定純度98.9%);D-半乳糖(分析純，上海試一化學(xué)試劑有限公司);硫酸奎寧(分析純，上海齊奧化工有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為三重蒸餾水。

1.1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠(河北北方學(xué)院動(dòng)物中心提供)。

1.1.3 儀器 XDS生物顯微鏡(重慶光電儀器總公司);H-7500透射電 子顯微鏡(日本);F-5100熒光分光光度計(jì)(日本);MP1100B型電子天平(上海精科天平儀器廠);GR-202型AND分析天平(日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模 采用 D-半乳糖致亞急性衰老法〔10〕，將D-半乳糖10000 mg溶于500 ml生理鹽水中，按注射劑量200 mg·kg－1·d－1(即每克體重0.01 ml)給小鼠腹腔注射，正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水，造模時(shí)間為8 w，每天稱(chēng)重一次，依據(jù)末次稱(chēng)重的克數(shù)調(diào)整給藥劑量。

1.2.2 模型驗(yàn)證 造模第6周和第8周分別選取正常組和造模組小鼠(備用)8只，摘眼球采血，分離血清，測(cè)定總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量，以驗(yàn)證小鼠衰老情況。第8周末，造模組小鼠指標(biāo)與正常組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示模型復(fù)制成功。

1.2.3 給藥方法 葒草苷和牡荊苷溶液的配制:葒草苷和牡荊苷先用N，N-二甲基甲酰胺溶解后，再加吐溫-80助溶，輕輕振蕩使混勻，然后再加入生理鹽水(N，N-二甲基甲酰胺∶吐溫-80∶生理鹽水 =1∶1∶20)。

正常組和模型組給等體積的生理鹽水，治療組分葒草苷、牡荊苷高(40 mg/kg)、中(20 mg/kg)、低(10 mg/kg)三個(gè)劑量組(按文獻(xiàn)〔8〕換算給藥劑量)，從第9周始每日上午分別灌胃給藥，維生素E對(duì)照組給藥劑量是20 mg/kg，依據(jù)小鼠體重調(diào)整給藥劑量，給藥時(shí)間8 w。

1.2.4 小鼠一般狀態(tài)觀察 觀察各組小鼠一般狀態(tài)，攝食及飲水情況、活動(dòng)度、毛色、光澤度等方面的改變情況。

1.2.5 小鼠腦組織重量的比較 精密稱(chēng)重各組小鼠全腦的重量，小鼠衰老后，腦組織微觀上會(huì)發(fā)生腦細(xì)胞的凋亡減少，宏觀上表現(xiàn)出腦萎縮等現(xiàn)象，觀察比較小鼠腦組織的重量。

1.2.6 小鼠腦組織脂褐素含量測(cè)定 利用脂褐素在紫外光激發(fā)下脂褐素能產(chǎn)生自發(fā)熒光，并且其熒光值與脂褐素值相對(duì)應(yīng)的特點(diǎn)，測(cè)定腦組織脂褐素的含量。計(jì)算出每克組織中所含相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)液熒光強(qiáng)度的熒光物質(zhì)微克數(shù)〔11〕。

(1)樣本處理將小鼠斷頭處死，取出腦組織在生理鹽水中浸泡，用濾紙瀝干表面血液污漬，按體積重量比為20∶1加入氯仿∶甲醇(V/V=2∶l)混合液，制成10%組織勻漿，再加入等體積蒸餾水，充分振搖3 min，3000 r/min離心10 min，吸出氯仿層，再加氯仿定容至5 ml。(2)用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度(激發(fā)光波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)420 nm，狹縫10 nm)。以新配制的硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)液(1 μg/ml)熒光強(qiáng)度為50，計(jì)算每克大腦皮層中所含相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度的熒光物質(zhì)微克數(shù)，即為脂褐素含量。

1.2.7 腦組織形態(tài)學(xué)的觀察

1.2.7.1 小鼠腦組織形態(tài)學(xué)光鏡觀察 小鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，然后打開(kāi)胸腔，夾閉腹主動(dòng)脈，經(jīng)左心室插管入主動(dòng)脈，灌注生理鹽水100～150 ml，快速?zèng)_洗，待血液沖洗干凈以后，馬上灌注含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.2～7.4)以固定腦組織。灌注完畢后，斷頭取腦，矢狀面切取腦組織0.1 cm，置于4%多聚甲醛中固定。固定完畢后，將標(biāo)本取出，經(jīng)梯度酒精逐級(jí)脫水，應(yīng)用HE染色法制作腦組織病理片。在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠腦組織的病理表現(xiàn)。

1.2.7.2 小鼠腦組織形態(tài)學(xué)電鏡觀察 用10%的水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g)，將小鼠麻醉，打開(kāi)胸腔，經(jīng)左心室插管進(jìn)入主動(dòng)脈，灌注生理鹽水，同時(shí)挑破右心耳，快速?zèng)_洗，待血液沖洗干凈以后，立即灌注含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.2～7.4)以固定腦組織。灌注完畢后，斷頭取腦，分離小鼠海馬區(qū)，放入2.5%戊二醛中固定，將固定好的樣本進(jìn)行小鼠海馬區(qū)的超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰小鼠一般形態(tài)的影響正常組小鼠飲食正常，活潑好動(dòng)、毛發(fā)光亮、濃密，皮膚彈性良好。模型組小鼠逐漸表現(xiàn)出少動(dòng)，行動(dòng)遲緩，喜蜷縮，毛色發(fā)黃，尤其是腹部毛發(fā)逐漸變得無(wú)光澤、稀疏并漸有脫毛現(xiàn)象，皮膚松弛，彈性下降。而各治療組在服用相應(yīng)的藥物后，總體狀態(tài)好于模型組。

2.2 葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦重量的影響造模后小鼠腦組織發(fā)生了萎縮，正常組小鼠腦組織重量與模型組相比，具有顯著性差異(P＜0.05);與模型組相比，葒草苷和牡荊苷高、中劑量組都具有顯著性差異(P＜0.05)，葒草苷高、中、低劑量組與牡荊苷各劑量組相比較，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 小鼠腦組織脂褐素的測(cè)定結(jié)果 正常組小鼠腦組織內(nèi)脂褐素的含量明顯低于模型組，具有顯著性差異(P＜0.01);葒草苷和牡荊苷各治療組的脂褐素含量明顯降低，與模型組相比具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01);與VE組相比，葒草苷及牡荊苷中、低劑量組降低腦組織脂褐素含量均具有顯著性差異(P＜0.05)，葒草苷和牡荊苷高劑量組與VE組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05);葒草苷高、中、低劑量組與牡荊苷各劑量組相比較，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)觀察(HE，×400)

2.4 小鼠腦組織形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果 (1)光鏡下病理學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。正常組小鼠腦組織細(xì)胞膜完好、排列整齊，無(wú)細(xì)胞變性，模型組小鼠腦組織細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞空泡變性，各治療組小鼠腦組織細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞排列較模型組明顯改善。(2)電鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。小鼠腦組織海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)，正常組細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核呈圓形和卵圓形，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)中線粒體清晰，無(wú)脂褐素沉積，模型組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯改變，可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞萎縮，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清或變形，線粒體膜出現(xiàn)部分損傷，出現(xiàn)腫脹變性、核膜模糊、核邊移、脂褐素沉積明顯增多，各治療組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯著改善，其中以葒草苷與牡荊苷高、中劑量組明顯。

圖2 各組大鼠超微結(jié)構(gòu)變化(×15000)

表1 葒草和牧荊苷對(duì)小鼠腦重量、脂褐素的影響( ± s，n=10)

表1 葒草和牧荊苷對(duì)小鼠腦重量、脂褐素的影響( ± s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與VE組比較:3)P＜0.05

組別 腦重量(g) 脂褐素(μg/g)0.491±0.037 18.25±1.62模型組 0.412±0.034 26.54±1.21 VE組 0.460±0.0321) 21.37±1.231)高劑量葒草苷組 0.451±0.0381)3) 21.12±1.301)中劑量葒草苷組 0.442±0.0261)3) 22.51±0.971)低劑量葒草苷組 0.431±0.0311)3) 23.65±0.821)2)高劑量牡荊苷組 0.446±0.025 22.26±1.031)中劑量牡荊苷組 0.423±0.0221)3) 24.01±0.951)2)低劑量牡荊苷組 0.426±0.0311) 25.07±0.672)正常組

3 討論

D-半乳糖所致的亞急性衰老模型，是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)糖代謝紊亂，導(dǎo)致最終破壞機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，積聚大量的自由基，破壞細(xì)胞膜，過(guò)氧化脂質(zhì)、脂褐質(zhì)等增高，導(dǎo)致擬衰老變化。通過(guò)連續(xù)注射D-半乳糖，可將6～8周齡的幼鼠誘導(dǎo)成相當(dāng)于兩年多的自然衰老動(dòng)物，是一種較為理想的模型。已經(jīng)廣泛應(yīng)用于衰老機(jī)制、老年疾病、抗衰老藥物篩選等方面的研究。

衰老是機(jī)體代謝過(guò)程中的一個(gè)必然階段，主要表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)環(huán)境刺激的適應(yīng)能力減弱以至喪失，出現(xiàn)多種器官組織功能的衰退并影響健康，在各器官的退行變化中腦衰老對(duì)人體的影響最大〔11〕。脂褐素是過(guò)氧化脂質(zhì)分解產(chǎn)物，是一種長(zhǎng)期積累在細(xì)胞內(nèi)殘余體，它隨年齡增長(zhǎng)而增多，因其常在老年動(dòng)物細(xì)胞中存在故又稱(chēng)老年色素是目前公認(rèn)的老化標(biāo)志之一〔12〕。

本試驗(yàn)結(jié)果提示金蓮花中葒草苷與牡荊苷各劑量組可降低小鼠腦中脂褐素的含量，以葒草苷與牡荊苷高、中劑量組作用明顯，形態(tài)學(xué)觀察提示，各治療組小鼠細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞核核膜逐漸恢復(fù)核質(zhì)改善明顯，提示金蓮花中葒草苷與牡荊苷通過(guò)改善衰老小鼠細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少腦神經(jīng)細(xì)胞的衰老或凋亡，以確保其功能的發(fā)揮，從而延緩衰老，這也可能是抗衰老的機(jī)制之一。

1 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典〔M〕.上海:上海人民出版社，1977:1398.

2 曲彩紅，顏 娟，田嘉銘，等.HPLC測(cè)定金蓮花中三種黃酮苷的含量〔J〕. 中成藥，2010;32(3):162-4.

3 顏 娟，胡海娜，田嘉銘，等.金蓮花中總黃酮抗氧作用的研究〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010;26(2):20-2.

4 楊國(guó)棟，饒 娜.金蓮花中葒草苷和牡荊苷體外抗氧作用研究〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011;22(9):2172-3.

5 孫 黎，程建貞，羅 強(qiáng)，等.金蓮花黃酮對(duì) K562，HeLa，Ec-109，NCI-H446細(xì)胞增殖的影響〔J〕.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009;44(5):981-3.

6 孫 黎，劉 芳，劉 華，等.金蓮花黃酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞作用的研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;29(9):1098.

7 孫 黎，羅 強(qiáng).金蓮花黃酮對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;131(2):82-3.

8 曲彩紅.金蓮花中葒草苷兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究〔D〕.河北北方學(xué)院，2010.

9 顏 娟.金蓮花中牡荊苷兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究〔D〕.河北北方學(xué)院，2010.

10 屈澤強(qiáng)，謝智光，王乃平，等.三七總皂營(yíng)抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005;22(2):130-3.

11 林 晨，沈偉哉，李藥蘭，等.不同溶媒中金蓮花提取物體外抑菌作用的比較〔J〕.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2001;22(6):54-5.

12 Sunanuma H，Kaburani S，et al.Ameliorative effect of dietary ingestion of lycopene and matorich on learn in impairment insenescence-accelerated mice〔J〕.Food Sci Tech Res，2002;8(2):183-5.