王利華 張 睿 田 強 陳 燕 張美增 (青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 青島 26602)

近年來隨著人口老齡化的進展，人的壽命逐漸增加。與此同時，阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病率也逐年增加。AD是一種進行性神經(jīng)退行性疾病，以近期記憶障礙為主要臨床癥狀，其特征性病理變化是老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)。有研究證實，大腦海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡和炎癥反應(yīng)可能是AD的發(fā)病機制之一〔1〕，目前尚無有效的治療措施。動物實驗研究表明，神經(jīng)調(diào)節(jié)素－1β(NRG－1β)能抑制腦缺血誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，具有一定的神經(jīng)保護作用〔2，3〕。本實驗試圖利用單側(cè)側(cè)腦室注射β淀粉樣蛋白1～40(Aβ1～40)的方法建立擬癡呆大鼠模型，從細胞凋亡和炎癥反應(yīng)角度探討NRG－1β治療AD的機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源 健康成年雄性Wistar大鼠40只，體重200～220 g，由青島市藥檢所實驗動物中心提供〔SCXK(魯)20070010〕。實驗前，將動物置于實驗室適應(yīng)環(huán)境1 w，自由進食、飲水;室溫(23±2)℃，自然光照。

1.2 學習記憶能力訓練〔4〕應(yīng)用Ⅰ－Ⅱ－Ⅲ三等臂式Y(jié)型電迷宮作為刺激器。首先將大鼠放入迷宮的Ⅰ臂，適應(yīng)3 min后進行刺激(電壓60 V，電流0.5～0.7 mA，持續(xù)2 s)。其余兩臂中的任一臂燈光亮信號示為安全區(qū)。如果大鼠進入安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)。第2步訓練以此安全區(qū)作為起步區(qū)，并使大鼠在安全區(qū)停留1 min鞏固記憶，再次給予電刺激，以此類推，按方向(Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ)依次改變安全區(qū)位置。學習測試:按上述方法每天固時間定訓練10次，連續(xù)7 d，以測試達到連續(xù)10次中有9次(9/10)正確反應(yīng)前所需的電擊次數(shù)，即嘗試次數(shù)表示學習能力。淘汰反應(yīng)過于遲鈍大鼠。記憶再現(xiàn)測試:學習測試完成24 h后以同樣方法進行，以達到9/10標準。正確反應(yīng)次數(shù)定為A，以A/10表示記憶的保持的能力，此值越高說明記憶力越好。

1.3 動物模型制備〔5，6〕將 Aβ1～40(Sigma公司)用 0.1 mol/L PBS稀釋成2 g/L，37℃孵育72 h，變?yōu)榫奂癄顟B(tài)。從上述40只大鼠中篩選具有學習和記憶能力的30只，隨機分為對照組、模型組和治療組各10只。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg體重)，固定于腦立體定位儀(江灣ⅠC)，顱頂正中線切開皮膚，用骨鉆鉆孔，以微量注射器垂直進針，向左側(cè)腦室(定位坐標AP=0.8 mm，ML=1.1 mm，DV=3.6 mm)緩慢注入凝聚態(tài) Aβ1～405 μl，1 μl/min，5 min 內(nèi)注射完畢，留針 5 min，以保證Aβ1～40充分彌散，緩慢退針，牙科水泥封固，縫合切口。對照組同步注射等體積0.1 mol/L PBS。

1.4 干預(yù)措施 將基因重組NRG－1β(R＆ D Systems，Inc)應(yīng)用0.1 mol/L PBS溶解稀釋成1 g/L的溶液。造模成功后7 d，用Y型電迷宮測試動物的學習記憶能力。然后，治療組按照5 μg/kg劑量，經(jīng)右側(cè)側(cè)腦室注射 NRG－1β 5 μl。對照組和模型組同步注射等體積0.1 mol/L PBS。對照組、模型組及治療組最終入組動物分別為8、7、7只。

1.5 評價指標

1.5.1 記憶再現(xiàn)測試 治療后7 d，用Y型電迷宮測定大鼠的學習記憶功能。

1.5.2 標本采集 行為測試后，10%水合氯醛麻醉動物，4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定，斷頭完整取腦，常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。自視交叉后方連續(xù)冠狀位切片(厚5 μm)，貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 細胞凋亡 切片常規(guī)脫蠟水化，按照TUNEL凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程公司)操作，光鏡下觀察，胞核有棕色顆粒者為陽性細胞。部分切片不加探針，用0.1 mol/L PBS代替，不出現(xiàn)陽性反應(yīng)。每只大鼠取4張連續(xù)切片，每張切片計數(shù)4個高倍視野中的陽性細胞數(shù)，取其均值。

1.5.4 免疫組化 兔抗鼠TNF－α抗體、SABC試劑盒、DAB染液購于武漢博士德生物工程公司。按試劑盒說明書操作，DAB顯色，光鏡下胞漿有棕色顆粒者為陽性細胞。部分切片不加一抗，用0.1 mol/L PBS代替，不出現(xiàn)陽性反應(yīng)。每只大鼠取4張切片，高倍鏡下海馬區(qū)隨機取4個視野，LEICA Qwin圖像處理系統(tǒng)分析各視野吸光度值(A)，減去背景A值，取其相對值(⊿A)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠學習記憶能力 模型成功后大鼠嘗試次數(shù)較造模前顯著性增多(P＜0.05)，即出現(xiàn)學習和記憶能力下降;但對照組前后無顯著性差異(P＞0.05)。NRG－1β治療7 d后，治療組動物嘗試次數(shù)較模型組顯著少(P＜0.05)，提示治療組學習和記憶成績優(yōu)于模型組，但嘗試次數(shù)仍顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.2 細胞凋亡 對照組、模型組和治療組動物海馬區(qū)均可見數(shù)量不等的凋亡神經(jīng)細胞，其中模型組和治療組凋亡細胞數(shù)量均顯著顯著高于對照組(P＜0.05)，治療組顯著低于模型組(P＜0.05)、但仍高于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠海馬區(qū)細胞凋亡和TNF-α表達(±s)

表1 各組大鼠海馬區(qū)細胞凋亡和TNF-α表達(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n 細胞凋亡 TNF－α(⊿A)5.3±2.12 0.18±0.06模型組 7 22.4±4.371) 0.46±0.121)治療組 7 13.6±3.621)2) 0.31±0.181)2)對照組8

2.3 TNF－α表達 TNF－α表達相對吸光度值(⊿A)在各組大鼠之間有顯著性差異(P＜0.05)。組間比較顯示，模型組TNF－α表達⊿A值顯著高于對照組(P＜0.05)，治療組⊿A值顯著低于模型組(P＜0.05)、但仍高于對照組(P＜0.05)。見表1。

3 討論

近年有研究表明〔7〕，Aβ是炎性反應(yīng)的啟動因素，Aβ可激活膠質(zhì)細胞，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，引起神經(jīng)毒作用。Bamberger等〔8〕發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞膜上的受體復(fù)合物與沉積在神經(jīng)元周圍的Aβ相互作用，使小膠質(zhì)細胞活化、增殖，并過量分泌促炎因子，介導(dǎo)炎癥損傷。炎性因子通過Toll樣受體4和核轉(zhuǎn)錄因子κB(TLR4－NFκB)信號傳導(dǎo)途徑引起 NF－κB 激活，促進諸如 TNF－α等靶基因激活，最終誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡〔9〕。星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞被缺血激活后產(chǎn)生炎性因子，與細胞膜受體TLR4結(jié)合，引起一系列氧化磷酸化過程，激活細胞內(nèi)NF－κB表達，活化的NF－κB進入細胞核促進TNF－α等炎性因子的mRNA轉(zhuǎn)錄，繼而上調(diào)其他相關(guān)炎性因子的表達，進一步加重炎癥反應(yīng)，損傷神經(jīng)細胞〔10〕。Li等〔2，3〕研究表明，NRG－1β 能抑制腦缺血誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)炎癥反應(yīng)和凋亡，縮小腦梗死體積，改善動物的行為功能，提示NRG－1β能有效地抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。?

1 Shimohama S.Apoptosis in Alzheimer′s disease－an update〔 J〕.Apoptosis，2000;5(1):9－16.

2 Li Q，Li Z，Mei YW，et al.Neuregulin attenuated cerebral ischemia－reperfusion injury via inhibiting apoptosis and upregulating aquaporin－4〔J〕.Neurosci Lett，2008;443(3):155－9.

3 李 琴，秦麗華，欒麗菊，等.神經(jīng)調(diào)節(jié)素對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡和STAT3和GFAP表達的影響〔J〕.解剖學報，2008;39(6):820－5.

4 王躍春.Y型電迷宮在大鼠學習記憶功能測試中的合理運用〔J〕.中國行為醫(yī)學科學雜志，2005;14(1):69－70.

5 Nabeshima T.Trial to produce animal model of Alzheimer′s disease by continuous infusion of beta－amyloid protein into the rat cerebral ventricle〔J〕.Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi，1995;15(5):411－8.

6 楚 晉，李 林.腦室灌注β－淀粉樣肽致癡呆動物模型〔J〕.中國藥理學通報，2004;20(7):827－36.

7 王子紅，文 彬，潘國際，等.治療阿爾茨海默病藥物的研究進展〔J〕. 中國臨床康復(fù)，2002;6(19):2938－9.

8 Bamberger ME，Harris ME，Mc Donald DR，et al.A cell surface receptor complex for fibrillar beta－amyloid mediates microglial activation〔J〕.J Neurosci，2003;23(7):2665－74.

9 Bi X，Yan B，F(xiàn)ang S.Quetiapine regulates neurogenesis in ischemic mice by inhibiting NF－kappaB p65/p50 expression〔J〕.Neurol Res，2009;31(2):159－66.

10 Boersma MC，Meffert MK.Novel roles for the NF－κB signaling pathway in regulating neuronal function〔J〕.Sci Signal，2008;1(6):pe7.