遲惠英 陳 川 郁志華 陳久林 申定珠 邢三麗 趙紅彬

(上海市中醫(yī)老年醫(yī)學研究所，上海 200031)

動脈粥樣硬化(AS)性疾病形成機制，有脂質浸潤、炎癥、血栓形成、單克隆、氧化應激等多種學說〔1〕，目前認為上述幾種學說均無法完全解釋其形成機制。近年來發(fā)現(xiàn)，AS患者端?？s短及端粒酶活性降低，這即明確其在本質上是增齡性的退行性病變。AS的模型多是基于高脂飲食，很少將衰老因素納入其中，這便與實際存在一定的脫節(jié)。在臨床上即可見一些有著頸動脈斑塊但是血脂正常的老年人。為此，本研究以大鼠為實驗動物，將高脂飼料合并腹腔注射維生素D3建立的經(jīng)典AS模型，與皮下注射D-半乳糖建立的亞急性衰老模型相結合，建立AS與衰老符合模型，并通過檢測相關指標，探討衰老在動脈硬化形成過程中所起的作用，及其對血脂等指標的影響，亦以有助于AS模型設計的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2月齡健康雄性SD大鼠，體重(200±20)g，購自上海中醫(yī)藥大學實驗動物部。

1.2 試劑與儀器 注射用維生素D3(上海通用藥業(yè)股份有限公司)，D-半乳糖粉劑(BIO BASIC INC)，總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、氧化型LDL(ox-LDL)試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)，丙二醛(MDA)測試試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成公司)。Power Wave XS微孔板分光光度計(BioTek)。

1.3 模型建立 在清潔級實驗環(huán)境下給予普通飼料適應性喂養(yǎng)1 w后，將SD大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為4組，分別為正常組，模型組(AS組)，衰老組，AS+衰老組。正常組及衰老組給予普通飼料，AS組及AS+衰老組給予高脂飼料(高脂飼料配方:3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.12%丙硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.38%基礎飼料)，各組自由飲食。參照文獻〔2〕所用維生素D3總劑量，按用藥時間及大鼠體重變化進行計算，并將傳統(tǒng)腹腔注射的方法改為灌胃以減小藥物的刺激作用，AS組每周以150 U/g維生素D3灌胃。D半乳糖組造模方法參照文獻〔3〕，每天以100 mg/kg D-半乳糖皮下注射。AS+衰老組灌胃維生素D3同時皮下注射D-半乳糖。灌胃量為1 ml，皮下注射量為0.2 ml。

1.4 檢測指標及方法 14 w后，將大鼠麻醉，腹主動脈取血，每只取5 ml注入非抗凝玻璃管中，室溫靜置2 h，3000 r/min離心15 min，取上清分裝在2 ml EP管中，－80℃保存?zhèn)溆?。檢測時將血清和試劑盒從冰箱中取出，平衡至室溫。按說明書要求配成各種工作液，以空白管調零，按說明書要求，測定相應波長的吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料采用±s表示，方差齊時多組計量資料采用單因素方差分析;若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗。

2 結果

2.1 各實驗組脂代謝相關指標水平的測定 見表1。與正常組比較，各實驗組TC、LDL-C水平明顯上升(P＜0.05)。AS+衰老組HDL-C含量與正常組有差別(P＜0.05)。動脈硬化指數(shù)(AI)各實驗組與正常組均有差異(P＜0.05)。對AS+衰老組與AS組和衰老組分別進行比較，以上四項指標均有明顯差異(P＜0.05)。與正常組比較，AS組、AS+衰老組TG水平升高(P＜0.05)。ox-LDL水平AS+衰老組與正常組有差別(P＜0.05)。AS+衰老組與AS組和衰老組分別進行比較，在ox-LDL和TG含量方面均可見升高趨勢，部分有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 各實驗組SOD及MDA水平比較 見表2。與正常組比較，其他實驗組血清MDA水平有升高趨勢，AS+衰老組有統(tǒng)計學意義，血清SOD水平均降低(P＜0.05)。證明無論是AS、衰老還是衰老伴隨AS都可以導致血清SOD水平的降低。

表1 各實驗組血脂水平比較( ± s，mmol/L)

表1 各實驗組血脂水平比較( ± s，mmol/L)

與正常組比較:1)P＜0.05;與AS組比較:2)P＜0.05;與衰老組比較:3)P＜0.05

56±1.32 1.06±0.28 AS組 9 1.78±1.451) 0.60±0.15 4.88±1.151) 2.97±2.321) 4.43±1.62 2.80±2.021)3)AS+衰老組 7 3.37±1.581)2)3) 0.35±0.161)2)3) 6.29±1.221)2)3) 11.71±6.571)2)3) 8.77±1.811)2) 2.16±1.221)3)衰老組 7 1.53±0.831)3) 0.59±0.14 2.44±0.931)2) 2.49±1.341) 4.26±2.08 1.10±0.282)LDL-C HDL-C TC AI ox-LDL TG正常組 8 0.36±0.24 0.76±0.26 1.14±0.32 0.46±0.30 3.組別 n

表2 各實驗組血清MDA及SOD水平比較(±s)

表2 各實驗組血清MDA及SOD水平比較(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與衰老組比較:2)P＜0.05

組別 n MDA(nmol/ml) SOD(U/ml)8 10.58±2.96 155.78±2.82 AS組 9 11.54±1.54 147.45±3.021)AS+衰老組 7 12.82±1.221)2) 149.58±3.991)衰老組 7 10.44±1.46 146.78±7.091)正常組

3 討論

文獻報道的可以引起AS的危險因素距今為止已有300多個，高脂血癥、高血壓、吸煙、糖尿病等是最早被公認的重要的危險因素。有文獻報道稱，LDL、血清TC水平升高與AS發(fā)病率呈正相關〔4〕。經(jīng)氧化修飾的ox-LDL能夠刺激巨噬細胞轉變?yōu)榕菽毎?，促進白細胞和血小板的黏附、聚集，平滑肌細胞增生，從而促進血栓形成，促進AS的發(fā)生和發(fā)展〔5〕。經(jīng)氧化應激后產(chǎn)生的ROS可以將LDL氧化生成ox-LDL，并進一步通過造成內(nèi)皮細胞損傷、導致內(nèi)皮功能障礙，促進巨噬細胞和平滑肌細胞增殖來促進AS的發(fā)展演化。氧化應激后生成的ROS可以調節(jié)轉錄活化因子AP-1和核因子NF-κB信號的表達，促進炎癥有關的基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。與LDL相反，HDL具有抗動脈粥樣硬化的作用〔6〕。它可以抵抗LDL的氧化修飾作用，參與膽固醇的逆向轉運，減少脂質在血管壁的沉積。HDL還能保護內(nèi)皮屏障功能，降低細胞黏附分子的表達，具有保護動脈血管的作用〔7〕。本實驗中，各模型組大鼠血清 TC、TG、LDL、AI、ox-LDL含量都有所升高，HDL水平降低，以AS+衰老組變化最為明顯，證明經(jīng)老化因素干預后，復合模型大鼠血脂較單純AS模型變化明顯。

AS時可以導致血清中SOD降低〔8〕。MDA是一種脂質過氧化物，其水平高低可以反映機體內(nèi)脂質過氧化程度，從而間接反映出細胞損傷的程度〔9〕。MDA通常與SOD相配合以反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度和機體清除氧自由基的能力。本實驗結果表明AS后血清中SOD降低而MDA相應的增高，證實AS后機體對氧自由基的清除能力減弱，而脂質過氧化程度加重。而AS+衰老組該項指標變化較另外兩造模組明顯，也證實了增齡在AS的形成過程中起到了一定作用。

流行病學調查表明，端粒長度的縮短與冠心病、腦卒中等AS性疾病的發(fā)生率隨年齡的增加而上升，而這與端粒、端粒酶隨增齡的變化趨勢也是一致的〔10〕。Benetos等〔11〕選取了163例高血壓男性用B超檢查是否存在頸動脈粥樣斑塊，同時測量起白細胞端粒長度。將結果進行對比發(fā)現(xiàn)，高血壓伴有頸動脈粥樣斑塊的患者，其白細胞端粒長度較無頸動脈粥樣斑塊的高血壓患者明顯縮短，說明白細胞端粒長度的縮短與頸動脈粥樣硬化的易患性有關。我所林水淼教授總結多年臨床經(jīng)驗，在國內(nèi)首次提出增齡導致動脈粥樣硬化的理論，并通過對模型動物用藥顯效證實了其理論的正確性〔12，13〕。

皮下注射D-半乳糖造成亞急性衰老模型與高脂飼料加維生素D3致AS模型組合，并與進行單項干預的實驗組進行比較，可見該復合模型較單因素造模在各項指標上有更加明顯的變化，證實年齡是影響AS的一個重要因素。

1 楊永宗.動脈粥樣硬化性心血管病基礎與臨床〔M〕.北京:科學出版社，2009:53-67.

2 楊鵬遠，芮耀誠，焦亞斌.動脈粥樣硬化大鼠實驗模型的建立〔J〕.第二軍醫(yī)大學學報，2003;24(7):802-4.

3 徐 智，吳國明.大鼠衰老模型的初步建立〔J〕.第三軍醫(yī)大學學報，2003;2(4):312-5.

4 Skalen K，Gustafsson M，Rydberg EK，et al.Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis〔J〕.Nature，2002;417(6890):750-4.

5 Lusis AJ.Atherosclenosis〔J〕.Nature，2000;407(6801):233.

6 Despres JP，Lemieux L，Dagenais GR，et.HDL-cholesterol as a marker of coronary heart disease risk:the Quebec cardiovascular study〔J〕.Atheroselerosis，2000;153(2):263-72.

7 von Eckardstein A，Hersberger M，Rohrer L.Current understanding of the metabolism and biological actions of HDL〔J〕.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2005;8(2):147-52.

8 林慶斌，廖升榮.SOD的研究進展〔J〕.化學世界，2006;5:378.

9 樊曉寒，惠汝太.高尿酸血癥與心血管疾病〔J〕.臨床心血管病雜志，2007;23(5):323.

10 Lakatta EG，Levy D.Arterial and cardiac aging:major shareholders in cardiovascular disease enterprises.PartⅠ:Aging arteries:a“set up”for vascular disease〔J〕.Circulation，2003;107(1):139-46.

11 Beneyos A，Gardner JP，Zureik M，et al.Short telomeres are associated with increased carotid atherosclerosis in hypertensive subjects〔J〕.Hypertension，2004;43(2):182-5.

12 徐品初，林水淼.補腎益氣方及其拆方對氧化低密度脂蛋白損傷血管內(nèi)皮細胞的影響〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2004;13(16):2129-30.

13 徐品初，林水淼.補腎益氣方及其拆方對ox-LDL所致“AS”癥血管平滑肌細胞病理模型的影響〔J〕.中藥藥理與臨床，2010;26(2):62-4.