朱賢關(guān) 李忠東 王建昌 孟如松 (安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，安徽 合肥 0000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)病機制有多種學(xué)說，如損傷反應(yīng)學(xué)說、AS氧化學(xué)說(oxidative hypothesis)等，實驗證明，他汀類、阿司匹林、維生素E和C等和某些中藥通過抗氧化作用，阻斷AS的發(fā)展。銀杏葉提取物(EGb)是天然中草藥銀杏葉的提取物，主要成分有黃酮類、萜類、原花色素類以及其他未知成分〔1〕。研究證明，該藥治療心腦血管疾病作用機制主要是抑制體內(nèi)自由基〔2〕和血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)的產(chǎn)生〔3〕。本文觀察活化血小板與內(nèi)皮細胞上的脂氧合酶同工酶(LOX－1)受體結(jié)合后對自由基產(chǎn)生的影響，并分析絲裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化通路產(chǎn)生炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(human coronary endothelial cells，HCAECs)。購自 ScienCellTM實驗室(ScienCellTMResearch Laboratories);血小板，健康成年志愿者，抽血前2 w內(nèi)未吸煙，未服用任何抗血小板藥物。

1.1.2 藥物、試劑及儀器 EGb(中國藥品生物制品檢定所);二氯二氫熒光素二乙酯(2′，7′－dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCF－DA)探針(Invitrogen 公司)，小鼠抗人 LOX－1 單抗(R＆D systems公司)，小鼠抗人 p－p38MAPK 單抗(Santa Cruz公司)，小鼠抗人 β－肌動蛋白(β－actin)抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠抗體(中杉金橋)。離心機，熒光顯微鏡，溫箱。

1.2 方法

1.2.1 活化血小板制備 健康成年志愿者，抽血前2 w內(nèi)未吸煙，未服用任何抗血小板藥物。未扎止血帶抽取新鮮靜脈血20 ml，注入含有3.8%枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝溶液的聚丙乙烯試管內(nèi)，上下顛倒輕搖充分混勻;立即室溫下1200 r/min離心5 min，收集富集血小板血漿(platelet－rich plasma，PRP);PRP 室溫下3000 r/min離心15 min，沉淀血小板用臺式緩沖液洗滌2次，并復(fù)懸于臺式緩沖液，調(diào)整血小板計數(shù)為2×108/ml〔1〕。加入終濃度為5 μmol/L的ADP，輕搖充分混勻20 min，即為活化血小板，備用。

1.2.2 分組 HCAECs培養(yǎng)參照以前實驗〔4〕，將第5～7代HCAECs隨機分為空白組、活化血小板組、活化血小板+EGb低劑量組(4 μg/ml)、活化血小板+EGb中劑量組(40 μg/ml)、活化血小板+EGb高劑量組(400 μg/ml)。活化血小板(2×108/ml)與內(nèi)皮細胞在37℃溫箱孵育12 h后，加入藥物EGb，再孵育12 h。

1.2.3 H2DCF－DA探針檢測活性氧(ROS)的表達 加入藥物再孵育12 h后，每組加入終濃度為2 μmol/L的H2DCF－DA探針，繼續(xù)孵育30 min，快速在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。用CMIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)研發(fā))分析采集圖像，以平均光密度(視覺平均顏色的深度)表示熒光強度。

1.2.4 Western印跡檢測LOX－1和磷酸化p38MAPK的表達取孵育完成的內(nèi)皮細胞，除去培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，胰酶消化收集細胞，加復(fù)蘇促進因子結(jié)合蛋白A(RIPA)裂解液，在冰上裂解，提取蛋白質(zhì)后二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白濃度測定。加上樣緩沖液，100℃變性10 min，10%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠(SDS－PAGE)電泳分離蛋白，再通過轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)到0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用Tris鹽酸鹽緩沖液(TBST)配制的5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗(LOX－1，1∶200;p－p38MAPK，1∶300;β－actin，1∶2000)，4℃過夜，TBST洗膜，5 min 3次，加HRP標記二抗(1∶10000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，5 min 3次，加 ECL顯影液，曝光。Quantity One軟件分析處理掃描圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)資料以±s表示，采用單因素方差分析，多樣本間均數(shù)比較采用完全隨機方差分析SNK－q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 活化血小板誘導(dǎo) ROS、LOX－1和磷酸化 p38MAPK(p－p38MAPK)表達 活化血小板與HCAECs孵育之后，可顯著誘導(dǎo) ROS產(chǎn)生，顯著誘導(dǎo) LOX－1和 p－p38MAPK表達(P＜0.05)。見圖1。

2.2 EGb抑制ROS產(chǎn)生 低、中、高劑量組平均光密度分別為0.89±0.27，0.53±0.07，0.42 ±0.16;空白組、活化血小板組平均光密度分別為0.29±0.04、0.97±0.24?？梢姴煌瑵舛鹊腅Gb對ROS的產(chǎn)生均有明顯的抑制作用(P＜0.05)，且具有劑量依賴性。圖1。

圖1 熒光顯微鏡下各組ROS表達水平

2.3 EGb抑制LOX－1表達 不同濃度的 EGb對LOX－1的表達均有明顯的抑制作用(P＜0.05)，且具有劑量依賴性。見表1，圖 2。

2.4 EGb抑制p－p38MAPK表達 EGb對 p－p38MAPK有顯著抑制作用(P＜0.05)，但EGb不同濃度對p－p38MAPK的表達抑制作用無顯著性差異。見表1，圖2。

圖2 LOX-1和p-p38MAPK Western印跡結(jié)果

表1 各組LOX-1和p-p38MAPK表達比較(n=3)

3 討論

目前證實，活化血小板主要與內(nèi)皮細胞LOX－1結(jié)合，通過一定通路介導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達大量ROS〔3，4〕，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能障礙，進而導(dǎo)致AS。本實驗證實，活化血小板與內(nèi)皮細胞結(jié)合12 h后，再加入EGb作用12 h，可使內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的ROS明顯下降，且具有劑量依賴性，提示EGb可能阻斷活化血小板與內(nèi)皮細胞LOX－1結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

內(nèi)皮細胞上LOX－1有多種配體，如ox－LDL、同型半胱氨酸、腫瘤壞死因子α(TNF－α)和活化血小板等，這些配體與 LOX－1結(jié)合后，可通過相同或不同的信號通道如p38MAPK、p44/42－MAPK、蛋白激酶 C(PKC)、蛋白激酶 B(PKB)、酪氨酸激酶(PTK)等激活還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶〔5〕等氧化酶產(chǎn)生大量 ROS和核轉(zhuǎn)錄因子(NF－κB)〔6〕表達，以及導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能失調(diào)〔7〕。何艷〔8〕等報道，銀杏黃酮苷元對 ox－LDL 誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞LOX－1表達具有抑制作用;梁燕玲〔9〕等研究證實，銀杏葉提取物對同型半胱氨酸誘導(dǎo)LOX－1 mRNA的表達具有抑制作用;徐西振〔10〕等發(fā)現(xiàn)EGb抑制TNF－α誘導(dǎo)的牛主動脈內(nèi)皮細胞LOX－1的表達。本實驗發(fā)現(xiàn)，活化血小板與內(nèi)皮細胞結(jié)合12 h后，加入EGb作用12 h，也可使內(nèi)皮細胞上LOX－1表達量下降，且具有劑量依賴性，提示EGb可以阻斷不同配體與LOX－1結(jié)合后的信號通路。

在上述信號通道中，MAPK介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物信號引起核反應(yīng)的重要通路，在細胞生長、增殖、分化及凋亡的調(diào)節(jié)中起到至關(guān)重要的作用。MAPK家族主要有細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(EKR1/ERK2)、應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)和p38MAPK，其中p38MAPK通路是參與內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)的細胞內(nèi)的重要通路，在致炎因子與LOX－1結(jié)合后，p38MAPK由非磷酸化轉(zhuǎn)化為磷酸化狀態(tài)，促進下游底物的磷酸化，啟動核因子，促進炎性介質(zhì)分泌，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與AS形成〔11〕。本實驗證實活化血小板與內(nèi)皮細胞結(jié)合12 h后，再加入EGb作用12 h，EGb可以抑制磷酸化的p38MAPK表達，提示活化血小板與內(nèi)皮細胞結(jié)合后的信號通路可能是p38MAPK通路，阻斷p38MAPK的磷酸化，阻斷AS的發(fā)展。

總之，EGb可通過阻斷活化血小板與LOX－1結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，p38MAPK通路可能是其主要通路，阻斷p38MAPK的磷酸化，阻斷AS的發(fā)展。

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