魏 文 李 運 楊曉冉 鞏 磊 (山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院眼科中心，山東 濟南 25002)

青光眼是嚴重危害視神經(jīng)視覺功能的常見的眼病之一，目前臨床主要根據(jù)眼壓、視乳頭的凹陷性萎縮、特征性視野缺損來進行診斷。高眼壓是其最主要的危險因素，臨床上往往是在視野缺損或視乳頭病理性改變之后才做出明確的診斷和治療，而此時病程已非早期，而且青光眼視功能損害是不可逆性，因此對青光眼的早期診斷、及時治療顯得尤為重要。我們建立慢性高眼壓動物模型，通過觀察眼壓在中度升高的情況下兔的眼底杯/盤面積比(C/DAR值)、視覺電生理a，b，Ops波的振幅及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)纖維數(shù)量的病理改變，研究視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和視功能的損傷，為青光眼的早期干預(yù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康新西蘭大白兔20只40眼(由山東省農(nóng)科院兔廠提供)，體重在2～2.5 kg，雌雄不限，經(jīng)裂隙燈檢查證實無眼前節(jié)病變，測量眼壓值均在正常范圍內(nèi)。

1.2 慢性高眼壓動物模型的建立與分組 5%戊巴比妥鈉1 ml/kg經(jīng)耳緣靜脈推注麻醉，肌肉注射15 mg/kg以維持麻醉。1%地卡因表面麻醉，經(jīng)角鞏膜緣處用1 ml空針做隧道刺入前房，抽取房水0.2 ml后，每只兔隨機一眼為高眼壓組(20眼)前房內(nèi)注入卡波姆(上海申興制藥廠)0.2 ml，后緩慢拔出空針，穿刺口自動封閉。另一眼為正常組(20眼)僅作前房穿刺，不做前房內(nèi)注入卡波姆。

1.3 術(shù)后觀察

1.3.1 眼壓 建模后，每日固定時間由同一人測量眼壓，如測眼壓連續(xù)兩日低于30 mmHg，即行前房內(nèi)重復(fù)注射卡波姆。

1.3.2 眼底照相 分別于建模前及后7、14、21、28 d在全麻下用眼底照相系統(tǒng)(日本TOPCON TRC.50I-X)行眼底照相。照相結(jié)果采用photoshop 7.0軟件計算C/DAR值。

1.3.3 閃光視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)檢查方法及條件 分別于建模前及后7、14、21、28 d在全麻下檢查 F-ERG。應(yīng)用 UTASE3000眼電生理儀器(美國LKC科技公司)，按照國際臨床視覺生理電生理學(xué)會制定的閃光ERG測試參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)(ISCEV ERG)〔1〕設(shè)置參數(shù)，檢查前充分散瞳，暗適應(yīng)40 min。脫毛，麻醉，固定電極，在暗紅光下將電極固定于兩眼連線中點和同側(cè)耳廓皮膚，分別作為參考電極和接地電極，眼表面麻醉后角膜接觸電極放置于角膜表面。依次記錄第一項暗視視桿細胞反應(yīng)、第二項暗視視桿細胞-視錐細胞混合反應(yīng)、第三項暗視振蕩電位。明適應(yīng)20 min后按上述步驟測量第四項明視單次閃光視錐細胞反應(yīng)、第五項明視30 Hz閃爍光視錐細胞反應(yīng)。取a波、b波、Ops波振幅為觀察指標(biāo)，每次每只眼測3次取平均值。

1.3.4 取材及病理標(biāo)本制作 分別于術(shù)后7、14、21、28 d隨機處死5只兔子，12點方位縫線標(biāo)記，完整摘除眼球，自球后1 mm橫斷視神經(jīng)，分別制成眼球及球后4 mm的視神經(jīng)標(biāo)本，置于10%的中性甲醛溶液中固定48 h后，常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明、浸蠟，包埋，平行于眼球剖面通過視神經(jīng)做6 μm連續(xù)切片6～9張，H-E染色，制成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞病理標(biāo)本。視神經(jīng)行橫斷面切片，3 μm連續(xù)切片3張，采用改良髓鞘染色法染色(麗春紅-亮綠染色法)〔2〕，膠原纖維等結(jié)締組織呈綠色，髓鞘及軸突呈紫紅色。

1.3.5 閱片及圖像分析 OlympusBX51顯微鏡下選取視盤周圍5 mm內(nèi)的視網(wǎng)膜標(biāo)本〔3〕，置于400倍下進行觀察拍照，用10×10目網(wǎng)格(1 mm2)計算10個方格中神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目，每只眼計數(shù)3張切片，每張切片取3個視野，取平均值。視神經(jīng)切片以10×100油鏡細致觀察，每例在不同位置采集3幅圖片供分析。在Mias圖像分析系統(tǒng)(分析軟件由四川大學(xué)圖像圖形研究所研制)下打開圖像，選擇圖像中髓鞘及軸突染色的紫紅色為目標(biāo)顏色，進行顏色分割，對計算機誤判的區(qū)域進行人工清除。利用“目標(biāo)計數(shù)”程序自動測量“目標(biāo)數(shù)目”。并以n/mm2表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0軟件進行配對資料t檢驗及組間兩兩比較的q(Newman-Keuls法)分析。

2 結(jié)果

2.1 眼壓改變 建模后高眼壓組眼壓均大于30 mmHg，兩組建模前比較無顯著性差異(P＞0.05)。兩組建模后各時間段比較均有顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

2.2 眼底照相

2.2.1 眼底照相改變 建模前兔眼底為粉紅色，視乳頭杯盤比約0.3。高眼壓組建模后7 d，視乳頭凹陷稍有限局性擴大。14 d時視乳頭凹陷擴大，顏色變淺，血管出現(xiàn)輕微移位(圖1)。21 d時視乳頭凹陷明顯擴大，乳頭顏色變淺，血管呈明顯的屈膝狀。28 d時視乳頭視盤面積明顯擴大、色淡，血管明顯屈膝、變細。對照組視乳頭形態(tài)無改變。

2.2.2 C/DAR值改變的比較 兩組建模前及建模后7 d時無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);14 d時出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。且隨著時間的延長，差異越顯著。見表1。

表1 眼壓值和各組C/DAR值比較(mmHg， ± s，n=20)

表1 眼壓值和各組C/DAR值比較(mmHg， ± s，n=20)

7 d 14 d 21 d 28 d高眼壓組 16.38±3.73 33.28±6.07 35.19±8.11 36.75±7.63 34.27±9.82 0.315±0.029 0.385±0.028 0.475±組別 眼壓建模前7 d 14 d 21 d 28 d C/DAR值建模前0.048 0.535±0.042 0.552±0.036正常組 15.81±2.72 16.79±2.91 16.53±3.17 15.86±2.86 17.46±3.39 0.324±0.030 0.319±0.034 0.327±0.039 0.311±0.052 0.320±0.028 P值 －0.01 0.01 0.01 0.01 0.4 0.06 0.04 0.02 0.01

2.3 標(biāo)準(zhǔn)ERG的改變

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)ERG a波振幅改變 兩組建模前及后7，14 d比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，21 d時出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。見表2。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)ERG b波振幅改變 兩組b波振幅于建模后7 d出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，且隨著時間的延長，差異越明顯。見表3。

表2 兩組a波振幅比較 (μV， ± s，n=20)

表2 兩組a波振幅比較 (μV， ± s，n=20)

時點 正常組 高眼壓組 P值建模前73.78±14.89 78.25±20.14 ＞0.057 d 78.40±16.11 60.03±16.17 0.3414 d 76.60±5.19 50.01±11.59 0.1521 d 72.20±6.19 38.40±12.24 0.0428 d 77.10±8.76 12.50±7.07 0.01

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)ERG的Ops波振幅改變 兩組Ops總振幅在建模后7 d時即出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，且隨著時間的延長，差異愈明顯。見表4。

2.4 組織病理學(xué)改變

2.4.1 視網(wǎng)膜組織切片觀察 光鏡下兔的正常視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)所見與人相似，呈明顯的結(jié)構(gòu)分層。外核層細胞數(shù)最多，有3～5層;內(nèi)核層細胞數(shù)較少，有2～4層;節(jié)細胞為單層，形態(tài)呈圓形或橢圓形，細胞核多偏于外側(cè)，細胞分布均勻、緊密，形態(tài)、大小近似?？梢郧宄乜吹絻?nèi)界膜、神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層和內(nèi)核層、外叢狀層、外核層等各層次(圖2)。建模后7 d:高眼壓組神經(jīng)節(jié)細胞排列稀疏，數(shù)目較正常組減少29.41%，但仍可見較多正常的神經(jīng)節(jié)細胞，兩組間節(jié)細胞數(shù)目比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。視神經(jīng)纖維層明顯變薄，偶見淋巴細胞浸潤，內(nèi)叢狀層水腫明顯，內(nèi)核層細胞減少，外叢狀層加厚，外核層細胞層數(shù)減少。14 d:高眼壓組的神經(jīng)節(jié)細胞都表現(xiàn)出明顯的細胞泡狀死亡，可見凋亡細胞，剩余神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯異常，主要表現(xiàn)為胞質(zhì)減少，細胞形態(tài)紊亂，神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)較正常組下降43.59%(圖2)，兩者之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。內(nèi)核層細胞層幾乎為單層，外叢狀層水腫明顯增厚，空泡連成片;內(nèi)叢狀層及外核層數(shù)減少。21 d:高眼壓組RGCs數(shù)目下降51.19%，且兩者之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。神經(jīng)纖維層、視神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)叢狀層高度水腫增厚，層次不清，可見較多淋巴細胞浸潤，外核層細胞排列稀疏。28 d:高眼壓組幾乎不能見到神經(jīng)節(jié)細胞(較正常組下降73.77%)，兩組比較有顯著性差異(P＜0.01)。內(nèi)核層細胞基本消失，外核層細胞排列更加稀疏。

表3 兩組不同時間段b波振幅比較(μV， ± s，n=20)

表3 兩組不同時間段b波振幅比較(μV， ± s，n=20)

與正常組各時間段內(nèi)比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

正常組建模前 102.7±19.6 110.7±23.1 220.3±19.5 216.5±22.時點 第一項高眼壓組 正常組第二項高眼壓組 正常組第四項高眼壓組 正常組第五項高眼壓組8 175.1±13.0 168.3±16.1 82.1±8.5 88.0±9.97 d 87.4±11.0 109.7±18.31) 159.3±25.7 199.0±13.61) 126.1±15.1 160.9±13.21) 66.1±15.1 82.1±8.21)14 d 57.6±16.3 98.8±19.61) 121.0±19.6 203.5±18.32) 89.6±10.1 165.1±13.22) 52.0±7.8 85.1±13.22)21 d 44.1±12.9 102.8±11.62) 78.3±21.3 214.1±25.52) 67.7±5.7 171.3±14.02) 40.2±6.3 83.8±5.72)28 d 20.8±14.6 105.0±10.32) 57.6±16.3 198.8±19.62) 42.2±16.3 169.0±14.92) 18.7±3.9 84.0±6.12)

2.4.2 視神經(jīng)軸突光鏡觀察 正常視神經(jīng)橫切面視神經(jīng)纖維排列緊密，纖維間質(zhì)無水腫和空泡變性，基質(zhì)均勻紅染;神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)正常，分布均勻，排列整齊。建模后7 d:高眼壓組視神經(jīng)纖維排列稍疏松，數(shù)目減少，纖維間質(zhì)空泡樣變性較多，水腫加重;膠質(zhì)細胞形態(tài)基本正常，伴輕度紊亂、增生;可見少量條索樣增生。14 d:高眼壓組視神經(jīng)纖維排列紊亂，數(shù)目減少，纖維間質(zhì)融合的空泡樣變性增多，水腫加重;膠質(zhì)神經(jīng)細胞體積大小不一，數(shù)目減少，排列不均勻;可見少量淋巴細胞浸潤(圖3)。21 d:高眼壓組視神經(jīng)纖維排列失去規(guī)律，數(shù)目減少，纖維間質(zhì)空泡樣變性大片融合，水腫進一步加重;膠質(zhì)神經(jīng)細胞體積大小不一，數(shù)目繼續(xù)減少;可見大片漩渦狀增生，較多成纖維細胞?？梢姶罅苛馨图毎?。28 d:高眼壓組視神經(jīng)纖維數(shù)目減少嚴重減少，大片纖維間質(zhì)空泡樣變性融合及水腫;膠質(zhì)神經(jīng)細胞罕見;可見較多團狀纖維增生，成纖維細胞。淋巴細胞浸潤。視神經(jīng)軸突定量圖像分析兩組視神經(jīng)纖維數(shù)目自建模后7 d時即存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異。見表5。

表4 兩組不同時間段Ops波振幅比較(μV， ± s，n=20)

表4 兩組不同時間段Ops波振幅比較(μV， ± s，n=20)

正常組 高眼壓組 P值建模前97.50±9.61 100.25±12.567 d 98.4±16.11 72.09±8.21 0.0214 d 97.6±5.19 63.03±5.71 0.0121 d 96.2±6.19 43.70±8.79 0.0028 d 97.10±8.76 16.65±3.46 0.00

表5 各組視神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)(個/10 mm2)和視神經(jīng)纖維計數(shù)(根/1 mm2， ± s，n=20)

表5 各組視神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)(個/10 mm2)和視神經(jīng)纖維計數(shù)(根/1 mm2， ± s，n=20)

組別 視神經(jīng)節(jié)細胞視神經(jīng)纖維98 845±659.8正常組 336.21±22.56341.12±27.13333.46±32.15318.91±26.2532962±915.2 32885±901.8 33127±878.3 32629±715.2減少率(%) 29.42 43.59 57.19 73.77 52.43 70.41 80.01 97.41 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.017 d 14 d 21 d 28 d高眼壓組 237.31±35.67192.44±40.36142.74±36.38 83.65±44.1316271±1019.39 732±810.0 6597±786.7 d 14 d 21 d 28 d

減少率=100%－高眼壓組剩余視神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目/正常對照組視神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目%

圖1 建模前和建模后14 d眼底照相

圖2 正常視網(wǎng)膜和高眼壓14 d神經(jīng)節(jié)細胞(×100)

圖3 正常視神經(jīng)和建模后14 d視神經(jīng)軸突(×100)

3 討論

青光眼時，眼球隨著高眼壓的持續(xù)存在，視網(wǎng)膜缺血缺氧的時間延長，節(jié)細胞缺血受損，其軸突構(gòu)成的視神經(jīng)損傷、變性〔4，5〕。青光眼視功能損害的病理學(xué)基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的進行性凋亡及視神經(jīng)纖維的喪失。隨著高眼壓持續(xù)時間的延長，視網(wǎng)膜光感受器的數(shù)量減少，內(nèi)核層、外核層和叢狀層排列發(fā)生紊亂，神經(jīng)節(jié)細胞凋亡和神經(jīng)纖維缺失的情況更加嚴重〔6，7〕。本研究病理切片結(jié)果顯示隨著高眼壓狀態(tài)的持續(xù)視網(wǎng)膜變薄，主要表現(xiàn)在神經(jīng)節(jié)細胞層、神經(jīng)纖維層，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)減少、細胞水腫變形、最終細胞核固縮，節(jié)細胞凋亡;視神經(jīng)纖維排列紊亂，間質(zhì)空泡樣變性，淋巴細胞浸潤，膠質(zhì)細胞增生最終凋亡，視神經(jīng)纖維數(shù)目減少率明顯增加。最終內(nèi)核層及外核層也受累及;與他學(xué)者的研究比較基本相同。

隨著高眼壓持續(xù)時間的延長，視神經(jīng)節(jié)細胞及其軸突呈進行性的損傷變性，在臨床上表現(xiàn)為C/DAR的擴大及視乳頭凹陷性萎縮。本實驗中兔眼底照相可見視乳頭凹陷加深，顏色變淡;盤沿變窄，變窄區(qū)域不對稱;血管移位，甚至屈膝狀。盤沿是視杯凹陷邊緣與視盤邊緣之間的環(huán)行區(qū)域，是視盤內(nèi)相當(dāng)于視神經(jīng)纖維的組織〔8〕，視盤盤沿區(qū)域變窄或者形成切跡，是青光眼視盤形態(tài)學(xué)改變的典型特征，C/DAR是指視杯面積與視盤面積之比，能在一定程度上反映視神經(jīng)纖維的數(shù)量。建模后高眼壓組C/DAR值隨著高眼壓持續(xù)時間的延長與正常組C/DAR值比較逐漸增大且存在統(tǒng)計學(xué)差異，出現(xiàn)進行性的盤沿組織的丟失，有研究表明在檢查出視野缺損之前，患者可能有多達40%的視神經(jīng)纖維喪失〔9〕。另有研究認為，臨床出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層缺損時，組織病理學(xué)檢查已有約50%的神經(jīng)纖維缺損，而視野改變又往往晚于眼底神經(jīng)改變約5年〔10〕。本實驗結(jié)果與以上兩位學(xué)者研究結(jié)果相似，甚至更嚴重。因此對于青光眼的防治，強調(diào)早發(fā)現(xiàn)早治療。

在本研究中F-ERG中Ops波和b波的振幅最為敏感，于建模后7 d開始出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，此時RGCs減少29.42%，神經(jīng)纖維數(shù)目明顯減少52.43%;a波則晚，在RGCs減少57.19%，視神經(jīng)計數(shù)下降80.01%時才出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)改變。F-ERG是視網(wǎng)膜受到光刺激后在角膜記錄到的一組視網(wǎng)膜電位變化。是反映視網(wǎng)膜功能狀態(tài)的敏感指標(biāo)，a波主要反映視網(wǎng)膜外核層光感受器的變化;b波反映視網(wǎng)膜內(nèi)核層的電活動，可能來源于Muller細胞和雙極細胞的跨膜電流〔11〕;Ops為疊加在b波上升支的3～5個小而快有節(jié)律子波的總和，也稱為振蕩點位，起源于視網(wǎng)膜內(nèi)核層，是反映視網(wǎng)膜血液循環(huán)情況的一個敏感的、客觀的、有效的指標(biāo)。本實驗結(jié)果表明持續(xù)性高眼壓通過視網(wǎng)膜循環(huán)障礙，導(dǎo)致內(nèi)核層功能下降，出現(xiàn)b波和Ops波振幅降低;最終為外核層受累，在21 d時a波振幅下降，出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義。其他學(xué)者的研究也表明〔12〕:隨著眼球缺血程度的加重，視網(wǎng)膜振蕩電位的振幅逐漸降低，潛伏期也延長，而且振蕩電位的異常早于眼底視乳頭的改變，對視網(wǎng)膜病變的早期診斷有重要價值。魏華〔13〕等對可疑開角型及早期開角型青光眼進行視覺電生理檢查，結(jié)果在可疑青光眼組中有20%OPs波出現(xiàn)異常，提示在開角型青光眼病人在出現(xiàn)視野改變以前可能存在OPs異常。因此Ops和b波是反映視網(wǎng)膜功能狀態(tài)的一個較敏感的指標(biāo)，可以作為青光眼在早期診斷一項客觀檢查。

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