羅文芳 唐 濤 林 源 羅杰坤 鐘鵬程 劉清娥

(中南大學湘雅醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，湖南 長沙 410008)

Th細胞是決定移植免疫排斥的關(guān)鍵成分，Th1細胞產(chǎn)生IFN－γ 和 IL－2 介導細胞免疫;Th2 細胞則產(chǎn)生 IL－4、IL－10 等，介導體液免疫。針對同種異體抗原的移植免疫應答主要是由Th1細胞介導。研究發(fā)現(xiàn)，在移植器官功能發(fā)生障礙之前，常檢測到 IFN－γ、IL－2 基因表達增高〔1〕。側(cè)腦室的腦室下帶(Svz)和海馬的顆粒下帶(SGz)集中于血管周圍，而且和內(nèi)皮細胞間僅隔一層基板，這種解剖上的毗鄰關(guān)系暗示了NScs和內(nèi)皮細胞間存在密切的聯(lián)系。本實驗模擬內(nèi)皮細胞與神經(jīng)干細胞的體內(nèi)環(huán)境建立共培養(yǎng)模型，觀察Th1/Th2細胞相關(guān)細胞因子的變化，探討同種異體內(nèi)皮細胞與神經(jīng)干細胞的免疫反應關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生3 d的Sprague－Dawley乳鼠6只，新生7～10 d Sprague－Dawley乳鼠20只，雌雄不拘，由中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物學部提供。

1.1.2 主要試劑及藥物 M199干粉培養(yǎng)基、D－Hank′s液干粉(Hyclone)，谷氨酰胺(上海伯奧)，肝素鈉、明膠、臺盼藍、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶(Sigma)，胎牛血清(杭州四季青)，DNaseⅠ(Roche)，多聚賴氨酸(武漢博士德)，bFGF、EGF(Pepro Tech EC)，抗Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體(美國PharMingen)，Trizo1試劑盒、DNA Marker、逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒、Pre Mix Taq(寶生物大連)，β－actin引物(上海生工)，一抗(Abcam)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、辣根酶標記鏈霉親和素、濃縮DAB試劑盒(北京中山)，其他常用試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 OLYMPUS IXTO倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，QWJ300TVBB型CO2培養(yǎng)箱(美國產(chǎn))，Sanyo超低溫冰箱(日本三洋)，ELX800酶標儀(美國產(chǎn))，超凈工作臺(蘇州凈化)，E260 電子天平(梅特勒)，Beckman J2－21 型低溫離心機(美國產(chǎn))，Beckman DU－640紫外分光光度計(美國產(chǎn))，Nikon倒置熒光相差顯微鏡(日本尼康)，PCR儀(美國ABI)，DDY多導電泳儀(北京六一)，UPW－5超純水儀(美國產(chǎn))，DHW－60恒溫水浴箱、DHP－81恒溫箱(上海醫(yī)用儀器廠)，50ml培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、濾器等耗材(Costar、Millipore等公司)。

1.2 方法

1.2.1 血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液的配制 用超純水溶解M199干粉培養(yǎng)基，配制成體積比為1∶1的 M199無血清培養(yǎng)基(每1000 ml培基中另加2.2 g碳酸氫鈉、1 g葡萄糖、0.9 g谷氨酰胺)，0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。使用前?EGF、bFGF 各 20 ng/ml，青 霉 素、鏈 霉 素 各 100 U/ml，ECGS 500 μg/ml，20%胎牛血清配成內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)液。

1.2.2 大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞的分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定

新生7～10 d SD乳鼠20只，75%酒精浸泡消毒5 min，斷頸處死，無菌條件下取腦，立即放入盛有4℃ D－Hank′s液的平皿中;仔細剔除大血管、軟腦膜、腦干、小腦及大腦髓質(zhì)，將大腦皮質(zhì)剪成1 mm3的小塊，加入20 ml含0.005%的 DNaseⅠ的D－Hank′s液，玻璃勻漿器上下勻漿20次;勻漿液用孔徑150 μm的不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集濾液，再用孔徑75 μm的不銹鋼濾網(wǎng)，棄濾液;用 D－Hank′s液沖洗濾網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的微血管段，1000 r/min×15 min離心，收集沉淀的微血管段。上述操作均在冰上進行。

將微血管段移入含0.005%DNaseⅠ的0.1%Ⅱ型膠原酶溶液中，37℃振蕩消化30 min;加入20%胎牛血清終止消化，1000 r/min× 15 min離心，棄上清后，加 D－Hank′s液清洗，1000 r/min×15 min離心，棄上清，洗滌2次，沉淀物加入內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)液，制成細胞懸液，接種于預先包被好明膠的玻璃培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，將細胞懸液轉(zhuǎn)入一次性培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d換液，觀察細胞生長情況。

原代培養(yǎng)7～10 d后，細胞呈單層密集生長，近亞融合時進行傳代繁殖。倒掉培養(yǎng)液后，以D－Hank′s液清洗2遍。0.25%胰蛋白酶37℃消化細胞約5 min，予20%胎牛血清終止消化。800 r/min×10 min離心，吸出消化液，D－Hank′s液清洗，離心，洗滌兩次，收集內(nèi)皮細胞，制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，以后每2～3 d換液一次至細胞鋪滿瓶底。

將細胞以2×105/ml細胞接種于預先放有洗凈、多聚賴氨酸溶液包被并消毒的小蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基為內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)2 d后，用Ⅷ因子相關(guān)抗原進行免疫細胞化學鑒定。

1.2.3 大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞的鑒定 Ⅷ因子相關(guān)抗原的免疫細胞化學檢測:將洗凈、多聚賴氨酸溶液包被、消毒后的小蓋玻片置于24孔板中，按傳代培養(yǎng)的方法，以密度為2×105/ml接種細胞3 d后，可見蓋玻片上長有一層細胞，0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次，每孔加入4%多聚甲醛室溫固定30 min;按SABC試劑盒說明書進行操作，陰性對照用0.01 mol/L PBS代替一抗進行。

1.2.4 測定細胞生長曲線 收集生長良好的細胞，經(jīng)胰酶消化，臺盼藍計數(shù)，以2×105/ml細胞密度接種于一次性24孔培養(yǎng)板中置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日消化3孔，以血細胞計數(shù)板計數(shù)，取3孔細胞數(shù)均值繪制細胞生長曲線。

1.2.5 海馬 NSCs的分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定〔2，3〕取新生(3 d)SD大鼠，斷頸處死，以75%酒精浸泡5 min，無菌條件下取出大腦放入含無菌0.01 mol/L PBS培養(yǎng)皿中，剝除腦膜，分離出海馬，將其剪成0.5 mm×0.5 mm大小的組織塊，移入10 ml玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入0.05%胰酶－EDTA消化15～30 min，20%胎牛血清終止消化，過200目細胞篩，收集細胞懸液于試管中，離心1000 r/min× 10 min，D－Hank′s液洗滌 3 遍，加入NSCs選擇培養(yǎng)液，吸管反復吹打制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度，按1×105個/ml接種于培養(yǎng)瓶，常規(guī)37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)。每3 d半量換液，待原代克隆形成后(約7～10 d)，以0.25%胰酶消化細胞克隆制成單細胞懸液進行傳代。

選取部分培養(yǎng)的細胞克隆種植明膠包被的24孔培養(yǎng)板上，加入含血清培養(yǎng)基DMEM/F12。2 d后以Nestin抗原進行免疫組織化學染色鑒定NSCs。

1.2.6 NSCs+MVEC共培養(yǎng) 腦微血管內(nèi)皮細胞以1×105/cm2的密度，種于包被2.5%明膠的OSTAR 24孔TRANSWELL外槽，以腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)72～96 h后，細胞匯片;D－Hank′s液洗細胞2次，在膜孔徑8.0 μm的內(nèi)槽種入傳代4 d的神經(jīng)干細胞球，分為共培養(yǎng)組(NSCs+MVECs)、空白對照組(NSCs)，培養(yǎng)48 h后，用熒光免疫細胞化學和RT－PCR技術(shù)檢測神經(jīng)干細胞中 INF－γ，IL－2，IL－4，IL－10 的表達。

1.2.7 免疫細胞熒光化學檢測 INF－γ，IL－2，IL－4，IL－10 蛋白表達 將洗凈、多聚賴氨酸溶液包被、消毒后的小蓋玻片置于24孔板中，按傳代培養(yǎng)的方法，以密度為2×105/cm2接種細胞3 d，蓋玻片上長有一層細胞后。分空白對照組、共培養(yǎng)組加以處理;每組設6個復孔，按上述條件干預各組細胞后，吸出培養(yǎng)液，按SABC試劑盒說明書進行操作。

以上操作除滴加封閉液后勿洗外，其他各步驟間均需用0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次。陰性對照用0.01 mol/L PBS代替一抗進行。

所有在同一條件下完成免疫組化染色的兩組細胞，按每組6孔、每孔于400倍光鏡下中隨機選取一個高倍視野拍照。

1.2.8 RT－PCR 檢測 INF－γ，IL－2，IL－4，IL－10 mRNA 收集各組細胞，按下述流程提取細胞總RNA。①取1 ml內(nèi)含106個細胞的培養(yǎng)液于1.5 ml EP管中;②4℃，12000 r/min離心30 s，棄上清;③加入1 ml Trizol，重懸細胞，室溫孵育5 min;④加入0.2 ml氯仿，振搖15 s，室溫孵育10 min;⑤4℃，12000 r/min離心15 min，收集上層無色水相于1.5 ml EP管中，去沉淀;加入等體積的異丙醇，混勻，室溫孵育 5～10 min;⑥4℃，12000 r/min離心10 min，棄上清;加入1 ml 75%乙醇并混勻;⑦4℃，12000 r/min離心10 min，棄上清;空氣中干燥10 min;⑧加入20 μl含1‰DEPC蒸餾水溶解 RNA，取2 μl RNA作凝膠電泳鑒定，確定RNA有無降解;再取1.5 μl 100倍稀釋，分光光度計測定A260和A280值，以測定RNA的含量及純度。余液于－70℃冰箱保存。

逆轉(zhuǎn)錄:取總 RNA 0.5 μg，Oligo(dT)18(50 μg/ml)引物1 μl，RNasin 1 μl，加 DEPC 水至 11 μl，70℃變性 5 min，在冰浴下加 5 × 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 4 μl，10 mmol dNTP 2 μl，RNasin 1 μl，加 DEPC 水至 19 μl;37℃，5 min;加 M－MLV 1 μl(200 U/μl)，總體積 20 μl;42℃，60 min 后;再 70℃，10 min。

PCR特異性引物用primer premier5.0軟件設計，由上海生物工程公司合成，各引物序列見表1。

擴增反應體系:取 Pre Mix Taq 12.5 μl，cDNA 2.0 μl，10 μmol/L目的引物 1.0 μl，β－actin 引物 1.0 μl加 DEPC 水至總體積25 μl，4000 r/min短暫離心后，于PCR儀中擴增。反應條件:預變性 94℃，5 min;變性94℃，30 s;退火溫度見表1，40 s;延伸72℃，45 s;35個循環(huán)，末次循環(huán)后72℃延伸7 min。取PCR 產(chǎn)物5 μl，加上樣緩沖液1 μl，2.0%瓊脂糖凝膠電泳，圖像分析儀攝片。采用Band Leader軟件分析數(shù)據(jù)，獲得各電泳條帶的吸光度值(X)，用β－actin的吸光度值(A)作為內(nèi)參照，計算基因的相對表達量(X/A)。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件，各組數(shù)據(jù)以±s表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗。

表1 基因擴增引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)及鑒定 倒置顯微鏡下觀察分離出的微血管段呈單枝或分枝狀，長約200～800 μm，直徑約20～30 μm;經(jīng)膠原酶消化后，微血管管壁模糊不清;3 d換液清除組織碎片和紅細胞后，可見散在貼壁的梭形內(nèi)皮細胞，排列不規(guī)則，核淡，胞膜明顯。5 d時細胞呈細長彎曲狀，7～9 d傳代后經(jīng)兔抗Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體免疫細胞化學染色，胞質(zhì)可見明顯的棕黃色著色，陰性對照無著色。符合Ⅷ因子相關(guān)抗原的分布特點，證實培養(yǎng)的細胞為血管內(nèi)皮細胞。見圖1。

2.2 大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞生長曲線 細胞計數(shù)后，以細胞數(shù)及培養(yǎng)時間繪制細胞生長曲線?？梢娂毎谇? d生長緩慢，第3天起迅速增長，6 d后生長減慢。由此選擇傳代后3～5 d進行共培養(yǎng)實驗。見圖2。

2.3 海馬成體神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定 海馬分離的細胞接種到無血清培養(yǎng)基上，2 d后大部分細胞死亡，10%細胞貼壁，其后形成2～4個細胞團，10 d后長出大小不一的細胞團，即神經(jīng)球(neurosphere)(圖3)，這些細胞球呈懸浮狀，形態(tài)規(guī)則，細胞免疫熒光化學發(fā)光法檢測均為Nestin抗原陽性(圖4)，可證明為神經(jīng)干細胞。將上述細胞克隆經(jīng)胰酶消化吹打制成單細胞懸液進行傳代培養(yǎng)，2～4 d后單個細胞又可重新形成克隆球(圖5)，并表達Nestin抗原。每次傳代后，均有少量細胞貼壁分化，而且隨傳代的次數(shù)增多，貼壁的細胞也有增多的趨勢，在7～8代左右還不影響細胞的傳代，而后分化加劇，大部分貼壁分化。

圖1 倒置顯微鏡觀察腦微血管內(nèi)皮細胞(×150)

圖2 大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞生長曲線

圖3 培養(yǎng)10 d后的神經(jīng)球(×200) 圖4 神經(jīng)干細胞Nestin熒光染色(×300)圖5 繼續(xù)傳代培養(yǎng)中的神經(jīng)球(×100)

2.4 免疫熒光細胞化學觀察 腦微血管內(nèi)皮細胞與神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)48 h后，經(jīng)免疫熒光細胞化學方法檢測，神經(jīng)干細胞球 IFN－γ(圖 6A、圖 6B)，IL－2(圖 6C、圖 6D)，IL－4(圖 6E、圖6F)，IL－10(圖 6G、圖 6H)均成陽性。見圖 6。

圖6 神經(jīng)干細胞球免疫熒光表達(×200)

2.5 RT－PCR檢測 RT－PCR檢測共培養(yǎng)神經(jīng)干細胞中細胞因子mRNA表達，共培養(yǎng)神經(jīng)干細胞中IL－2、INF－γ mRNA的表達上調(diào)，IL－4、IL－10 mRNA 的表達下調(diào)，與空白對照組比較差異顯著(P＜0.01)。見圖7。

圖7 共培養(yǎng)神經(jīng)干細胞中細胞因子mRNA表達

3 討論

機體在正常狀態(tài)時Th1和Th2細胞功能處于動態(tài)平衡，當機體因識別自體或異體抗原而發(fā)生免疫應答時，一旦反應向著Th1/Th2二者其中某一方向分化，則相應亞群通過自分泌方式增強其作用(正反饋)，同時以旁分泌方式抑制向?qū)Ψ降姆只?。在移植免疫應答中，一般認為Th1參與同種移植的急性排斥反應，Th1細胞因子和排斥反應相關(guān);而Th2細胞在同種移植中易于誘導移植耐受。

免疫應答中的一個重要過程是抗原提呈，即抗原提呈細胞(APC)通過捕捉和處理抗原，并以MHC分子限制形式提呈免疫活性細胞，導致后者激活產(chǎn)生免疫效應。移植排斥反應的關(guān)鍵是供、受體MHC不相容，MHC主要分為MHC－Ⅰ和MHC－Ⅱ類分子，Mason等〔4〕認為MHC－Ⅱ類抗原在誘導同種移植免疫排斥反應中起關(guān)鍵作用。無論是異種還是同種異體腦內(nèi)移植均可存在免疫排斥反應，可能主要與MHCⅡ類分子有關(guān)，是由MHCⅡ類抗原不同而誘發(fā)的〔5〕。

神經(jīng)干細胞是一種來源于神經(jīng)組織或可向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的前體細胞，很少表達MHC抗原，故一直認為神經(jīng)干細胞具有極低或無免疫原性，是一種比較“純凈”的細胞群，同時缺乏APC細胞(如內(nèi)皮細胞或小膠質(zhì)細胞)，雖然早期的NSCs無MHC表達，但隨著體外傳代次數(shù)增加，細胞表面開始表達MHCⅡ類分子〔6〕。側(cè)腦室的腦室下帶(Svz)和海馬的顆粒下帶(SGz)，集中于血管周圍，而且和內(nèi)皮細胞間僅隔一層基板，這種解剖上的毗鄰關(guān)系暗示了NScs和內(nèi)皮細胞間存在密切的聯(lián)系，在異基因神經(jīng)干細胞移植治療時血管內(nèi)皮細胞可作APC，據(jù)此推測異基因神經(jīng)干細胞移植治療腦出血可能會發(fā)生免疫排斥反應，神經(jīng)干細胞不易存活，移植手術(shù)失敗。

本實驗采用Transwell建立神經(jīng)干細胞與腦微血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)模型，用熒光免疫化學和RT－PCR測定NSCs中與Th1相關(guān)的 IFN－γ、IL－2，與 Th2 相關(guān)的 IL－4、IL－10 的表達，結(jié)果顯示兩種細胞共培養(yǎng)后，神經(jīng)干細胞呈 INF－γ，IL－2，IL－4，IL－10 陽性;并且與空白對照組比較，共培養(yǎng)組 IL－2，INF－γmRNA的表達上調(diào)，IL－4，IL－10mRNA 的表達下調(diào)。

IL－2、IFN－γ 和 IL－4、IL－10 分別是 Th1 與 Th2 細胞所分泌的代表性的細胞因子，在Th1/Th2分化偏移過程中發(fā)揮著獨特作用。Th0向Th1/Th2分化的關(guān)鍵事件，是IL－12受體β鏈第二個亞單(IL－12Rβ2)的表達，以及由 IL－12Rβ2受體啟動的信號傳導。IL－12Rβ2 的表達受 IFN－γ 和 IL－4 的正負調(diào)節(jié)。IFN－γ 與IL－4、IL－10能分別促進 Th1和 Th2的分化并抑制對方的表達〔7〕。因此，若能增強 IL－4、IL－10 的表達，或抑制 IFN－γ 的作用，就可以上調(diào)Th1、下調(diào)Th2表達，而有助于移植耐受的形成。

CD4+Th細胞不同亞群在移植免疫中通過其分泌的細胞因子各自發(fā)揮著獨特作用:Th1細胞分泌的IFN－γ、IL－2等參與介導移植排斥反應〔8〕;Th2 細胞分泌的 IL－4、IL－10 等則抑制CD4+Th細胞向Th1細胞分化，易于誘導移植耐受〔9〕。因此，定向調(diào)控Th細胞分化，成為誘導移植免疫耐受的策略之一。

NSCs具有無限增殖和多分化潛能。NSCs移植治療腦出血，促進缺失的神經(jīng)功能恢復具有巨大臨床應用前景。因此，定向調(diào)控Th細胞亞群分化，即阻斷Th1細胞及其所分泌的細胞因子的效應，或增強Th2細胞及其所分泌的細胞因子的效應已成為誘導移植免疫耐受的策略之一。

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