杜海軍 王 湛 尉秀霞 周 玲* 馬 晶 馮 霞 葉樹清 曾 毅*

（中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防與控制國家重點實驗室，北京100052）

樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）是1973年美國洛克菲勒大學(xué)的Steinman和Cohn教授從小鼠的外周淋巴器官首次發(fā)現(xiàn)的[1]，是體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細(xì)胞（Antigen present cell，APC），也是唯一能激活初始型T細(xì)胞的APC，被稱為天然“免疫佐劑”，在抗感染、抗腫瘤、移植排斥等過程中發(fā)揮重要作用[2]。目前以DC為基礎(chǔ)的疫苗在治療腫瘤方面，尤其在某些晚期腫瘤等的臨床治療方面已經(jīng)取得一些的成效[3-7]。鼻咽癌（Nasoparyngeal carcinoma，NPC）是我國南方一些?。ㄗ灾螀^(qū)）的常見惡性腫瘤之一。目前放射治療是鼻咽癌治療的基本方法，但中晚期鼻咽癌治療后常常復(fù)發(fā)或向遠處轉(zhuǎn)移，對于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者在臨床上尚無有效治療方案。EBV-LMP2是NPC細(xì)胞表達的病毒抗原之一，是誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的理想靶抗原。以DC為基礎(chǔ)的疫苗其免疫方式報道多為靜脈回輸、淋巴結(jié)注射和皮內(nèi)（下）注射[8-11]。我們以肌肉免疫方式注射DC-EBV-LMP2，研究LMP2誘導(dǎo)的特異性CTL。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Balb/C鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。優(yōu)級胎牛血清購自Invitrogen公司。rAd-LMP2：深圳清華源興生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)。LMP2單抗購于SantaCruz公司；熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG及HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購自北京中衫生物技術(shù)公司；流式檢測抗體購自Biolegend公司；重組小鼠細(xì)胞因子購自Peprotech公司；ELispot Kit購自BD公司；細(xì)胞培養(yǎng)液由病毒病預(yù)防控制所配液室提供。

1.2 小鼠骨髓細(xì)胞分離與DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)

斷頸法處死小鼠，取出小鼠股骨骨髓，制成成單細(xì)胞懸液，以小鼠淋巴細(xì)胞分離液（達科為）分離骨髓細(xì)胞（2000rpm/min，30min）。洗滌2次（1500rpm/min，10min），獲得小鼠骨髓細(xì)胞。以4×106/孔濃度接種在6孔培養(yǎng)板中，37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h。輕微晃動培養(yǎng)液，吸掉上清中的懸浮細(xì)胞，以無血清1640輕輕沖洗3～4遍，加入含細(xì)胞因子（rmGM-CSF200U，rmIL-410U，rmTNF-α100U）10%胎牛血清的RPMI1640，37℃5%CO2培養(yǎng)，3d后，半量更換含細(xì)胞因子培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至7d。

1.3 DC-EBV-LMP2制備

用移液管吹打細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞團，1500rpm/min，離心10min，獲得小鼠的DC。以100Tcid50的rAd-LMP2感染吸附DC1小時（體積在0.5～1mL內(nèi)），然后在含細(xì)胞因子（rmGM-CSF200U，rmIL-410U，rmTNF-α200U）10%胎牛血清的RPMI1640作用下，培養(yǎng)48h。第9天收集成熟的樹突狀細(xì)胞（1500rpm/min，10 min）。

1.4 DC表達LMP2的檢測：

取5μL DC-EBV-LMP2懸液滴在載玻片的小孔內(nèi)，晾干后，冷丙酮4℃固定。分別以LMP2單抗（1?100稀釋）、生物素標(biāo)記標(biāo)IgG抗體（1∶100稀釋）、辣根過氧化物酶標(biāo)記標(biāo)抗生物素的IgG抗體（1∶100稀釋）與涂片細(xì)胞作用（37℃，40min）。每次PBS沖洗3遍。最后將細(xì)胞片浸泡于聯(lián)苯二胺顯色液中1min，然后在顯微鏡下觀察LMP2在DC中表達。

1.5 DC-EBV-LMP2免疫Balb/C鼠實驗

將Balb/C鼠30只，分為3組，按（表1）的設(shè)計進行小鼠免疫。在初次免疫后的第5周和第8周，處死小鼠（每次每組5只），取脾臟分離淋巴細(xì)胞進行LMP2特異性細(xì)胞免疫檢測。

表1 小鼠免疫方案設(shè)計

1.6 小鼠IFN-γElispot的檢測

按照試BD劑盒使用說明，將包被抗體，以2.5×105/孔接種細(xì)胞，LMP2多肽（AAALALLASLIL和ASCFTASVSTVV各2μL/孔）刺激物5μg/mL，設(shè)陽性對照1×105/孔（加PHA或ConA刺激1μg/孔）、陰性對照2.5×105/孔、空白對照（加100μL/孔培養(yǎng)液）。按說明書步驟依次加入檢測抗體、酶標(biāo)的鏈霉親和素和顯色液。用BiosysBioreader4000PRO自動讀板儀讀取斑點，并作統(tǒng)計分析。

1.7 CD8+T/CD3+T亞群檢測

按說明書在淋巴細(xì)胞中加入熒光標(biāo)記CD8和CD3抗體，同時設(shè)置陰性對照（空白）、單色陽性對照及多色檢測樣本，室溫孵育20min。PBS洗滌2次，200目濾網(wǎng)過濾后，流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 DC制備與LMP2在DC中的表達

在細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，小鼠骨髓分離的單核細(xì)胞逐步分化成樹突狀細(xì)胞。以100 MOI rAd-LMP2感染DC 48h后，免疫酶法可以檢測到LMP2在DC中表達（圖1）。

圖1 LMP2在小鼠骨髓來源DC中表達檢測

2.2 DC-EBV-LMP2誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答

經(jīng)過0、2、4周免疫后，用IFN-γElispot法測定LMP2特異性CTL，結(jié)果顯示DC-EBV-LMP2免疫組特異性CTL（308±167）數(shù)量明顯高于PBS組（18±6）和DC組（26±12）。統(tǒng)計學(xué)分析：P＜0.01具有顯著差異（圖2）。在免疫后的第8周仍然檢測到，只是較第5周有所降低（圖3）。

2.3 免疫后細(xì)胞亞群變化

以流式細(xì)胞儀檢測各實驗組中CD8+T/CD3+T細(xì)胞亞群的比值，數(shù)據(jù)顯示在小鼠0，2，4周免疫后的第5周，DC-EBV-LMP2免疫組CD8+T/CD3+T細(xì)胞亞群的比值較PBS和DC組有所升高，但統(tǒng)計學(xué)軟件分析P＞0.05，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。而在第八周再次檢測CD8+T/CD3+T細(xì)胞亞群的比值時是顯示，DC-EBV-LMP2免疫組CD8+T/CD3+T細(xì)胞亞群的比值低于PBS和DC組。

圖2 小鼠0、2、4周免疫后第五周IFN-γElispot檢測結(jié)果

圖3 小鼠免疫后第八周IFN-γ Elispot檢測結(jié)果

3 討論

我們以前研究結(jié)果表明：以pcDNAⅢ-LMP2真核表達質(zhì)粒免疫小鼠可誘發(fā)LMP2特異性細(xì)胞和體液免疫[12]。rAd-LMP2以灌胃、肌肉注射和滴鼻的方式感染小鼠，均可誘發(fā)小鼠針對LMP2的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫[13,14]。EBV-LMP2DNA疫苗、腺相關(guān)病毒（adenoassociated virus，AAV）疫苗、非復(fù)制5型腺病毒疫苗（Ad5）聯(lián)合免疫Balb/C小鼠能夠更好地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答[15]。rAd-LMP2肌肉免疫恒河猴可以誘導(dǎo)EBV-LMP2特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答及抗體應(yīng)答，且免疫應(yīng)答水平的高低與病毒劑量的高低相關(guān)[16]。rAd5F35-LMP2重組腺病毒疫苗在恒河猴體內(nèi)誘導(dǎo)EBV-LMP2特異性的免疫應(yīng)答[17]。國內(nèi)外眾多的文獻報道，DC的免疫途徑有皮下、皮內(nèi)、淋巴結(jié)注射和靜脈回輸?shù)龋匆娪屑∪饷庖叩膱蟮?。本研究的實驗結(jié)果證實DC-EBV-LMP2肌肉免疫小鼠后能夠誘導(dǎo)LMP2特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。由于LMP2刺激產(chǎn)生了較強的細(xì)胞免疫應(yīng)答，生成大量的直接具有殺傷效應(yīng)的細(xì)胞即細(xì)胞毒T細(xì)胞，造成了免疫后DC-EBV-LMP2組較PBS和DC組的CD8+T細(xì)胞亞群有所增高，DC免疫組與PBS組比較也有所升高，可能為DC刺激所致。隨著特異性CTL與靶細(xì)胞結(jié)合后釋放穿孔蛋白使靶細(xì)胞破裂，免疫應(yīng)答結(jié)束，大部分細(xì)胞死亡，微量變成記憶T細(xì)胞長期存在。

由于記憶T細(xì)胞存在，使我們在第八周仍能夠檢測到LMP2特異性的免疫應(yīng)答，雖然隨著時間的推移，絕大多數(shù)的CTL已經(jīng)死亡，因而免疫應(yīng)答強度有所降低，流式細(xì)胞儀檢測DC-EBV-LMP2組CD8+T細(xì)胞亞群比值明顯低于其他兩組，恰好是一個有力的證據(jù)。除此之外，我們注意到免疫后第八周CD8+T細(xì)胞亞群水平整體上有所降低，一方面由于小鼠自身CD8+T細(xì)胞亞群經(jīng)過擴增后，除記憶細(xì)胞外，其余的大部分凋亡細(xì)胞所致，另一個原因可能是不同老鼠實驗批次間的差異造成，隨著時間延長小鼠“衰老”也可能起一定的作用。在實驗中我們未檢測CD4+T細(xì)胞在小鼠免疫應(yīng)答過程中的變化，尤其是CD25+CD4+T細(xì)胞亞群在特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中，起著維持自身耐受和避免免疫反應(yīng)過度損傷機體的重要作用，也許與CD8+T/CD3+T的比值變化相關(guān)。

從我們目前的實驗結(jié)果分析，雖然DC-EBV-LMP2組誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答的水平明顯高于PBS和DC組，但組內(nèi)小鼠間的數(shù)值差異較大，在今后的實驗中需要進一步增加每組小鼠的數(shù)量，減小鼠間差異。免疫后隨著時間的延長，免疫應(yīng)答的強度衰減，這提示我們在今后的臨床免疫治療中，需要再次免疫或與其它疫苗聯(lián)合應(yīng)用來維持細(xì)胞免疫的強度。我們正在進行這一方面的探索。

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