(廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣州 510120)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，白血病存在Ras/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶人第10染色體缺失磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)/蛋白激酶(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶體蛋白(mTOR)和(或)Ras/Raf/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶(MEK)/絲裂原活化蛋白激酶(ERK)等關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常［1，2］。磷酸化蛋白如 p-Akt和 p-ERK1/2 的激活，會(huì)使腫瘤細(xì)胞增殖潛能、逃避凋亡和免疫殺傷的能力增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞增殖失控，對誘導(dǎo)凋亡的藥物敏感性下降并導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生［3，4］。這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的磷酸化蛋白有望作為分子靶向治療的位點(diǎn)之一。2011年10～12月，本研究對粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562采用通路靶點(diǎn)抑制劑U0126(MEK抑制劑)、LY294002(PI3K抑制劑)和雷帕霉素(mTOR抑制劑)以及激活劑佛波酯(PMA，ERK激活劑)進(jìn)行處理，觀察兩種關(guān)鍵信號通路的活性狀態(tài)與K562細(xì)胞對柔紅霉素(DNR)和阿糖胞苷(Ara-C)敏感性的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 RPMI1640和胎牛血清購自美國Gibco公司;細(xì)胞固定液(含16%甲醛)、細(xì)胞破膜液Ⅲ(含90%甲醇)、Stain Buffer、Annexin Ⅴ/PI凋亡試劑盒購自美國Becton Dickinson公司;IGG1鼠抗人單克隆抗體、p-Akt T308-PE、p-Akt S473-Alexa 647、p-ERK1/2-Alexa 488購自美國Becton Dickinson公司;U0126、LY295002、雷帕霉素、佛波酯(PMA)購自美國Sigma公司;柔紅霉素購自深圳萬樂公司;阿糖胞苷購自哈爾濱萊博通公司;K562由廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院生物工程室饋贈(zèng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將K562置于含有15%胎牛血清(FPS)的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、含5%CO2、飽和濕度的恒溫孵育箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用含有10%FPS的RPMI1640重懸K562細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到(1～5)×106/mL。將細(xì)胞分為5個(gè)組，經(jīng)U0126、LY294002、雷帕霉素處理的細(xì)胞分別為抑制劑A、B、C組，經(jīng)PMA刺激的細(xì)胞為激活劑組，未作處理者為對照組。

1.3 K562中磷酸化蛋白的檢測 細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白抗體標(biāo)記:IGG1陰性對照管為IGG1-Alexa 488/IGG1-PE/IGG1-Alexa 647;磷酸化抗體標(biāo)記管為p-ERK1/2-Alexa 488/p-Akt T308-PE/p-Akt S473-Alexa 647。根據(jù)所標(biāo)記單抗使用要求，K562分別予固定、破膜處理后［1］，加入上述單抗進(jìn)行胞內(nèi)磷酸化信號蛋白的標(biāo)記。采用磷酸化流式細(xì)胞術(shù)檢測K562中的 p-ERK1/2、p-Akt T308 和 p-Akt S473。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 將5組細(xì)胞分別加入DNR、Ara-C，對照組不加藥。細(xì)胞于37℃、5%CO2環(huán)境中孵育48 h。采用AnnexinⅤ/PI標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡率。取細(xì)胞密度為(1～5)×106/mL的細(xì)胞懸液1 mL，分別加入AnnexinⅤ和PI，混勻，室溫避光孵育15 min。加入Wash Buffer上流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組K562中磷酸化蛋白的表達(dá)變化 見表1。

表1 各組K562中磷酸化蛋白的表達(dá)變化(%，±s)

表1 各組K562中磷酸化蛋白的表達(dá)變化(%，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05

組別p-Akt T308 p-Akt S473 p-ERK1/2對照組83.24 ±14.29 51.82 ±1.32 54.55 ±30.56激活劑組 94.70 ± 3.53 72.55 ±5.44* 97.85 ± 3.07*抑制劑 A 組 87.35 ± 0.07 52.55 ±5.44 6.75 ± 0.50*抑制劑 B 組 57.60 ± 0.74* 17.00 ±0.29* 18.25 ± 1.48*抑制劑C組81.24 ±11.19 50.98 ±0.41 52.95 ±26.76

2.2 Ara-C和DNR作用后各組K562細(xì)胞凋亡率比較 見表2。

表2 Ara-C和DNR作用后各組K562細(xì)胞凋亡率比較(%，±s)

表2 Ara-C和DNR作用后各組K562細(xì)胞凋亡率比較(%，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05

組別 K562細(xì)胞凋亡率Ara-C作用后 DNR 作用后對照組65.15 ±0.21 58.50 ±0.57激活劑組 48.10 ±2.83* 23.40 ±2.78*抑制劑 A 組 63.80 ±0.15 89.70 ±3.12*抑制劑 B 組 72.60 ±2.07* 79.70 ±1.26*抑制劑 C 組 82.50 ±0.33* 88.60 ±2.04*

3 討論

Ras/PI3K/Akt/mTOR是標(biāo)準(zhǔn)的生存通路，在白血病等多種惡性腫瘤中被激活。其初級效應(yīng)分子Akt激活后轉(zhuǎn)入核內(nèi)磷酸化一系列胞內(nèi)底物，這些底物參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)化［5］。實(shí)驗(yàn)證明，與沒有Akt激活的細(xì)胞相比，存在Akt活化的細(xì)胞株在化療藥物的作用下增殖力和集落生成能力增強(qiáng)［6］。研究表明，Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR通路活化與多種腫瘤發(fā)生耐藥有關(guān)，而阻斷Ras/PI3K/Akt/mTOR的磷酸化蛋白表達(dá)能快速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，尤其適用于腫瘤的聯(lián)合治療［7］。ERKs位于一系列受體的下游，活化轉(zhuǎn)入核內(nèi)磷酸化其他轉(zhuǎn)錄因子［8，9］，主要通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性從而產(chǎn)生耐藥。抑制Ras/Raf/MEK/ERK通路中的Raf和MEK能提高白血病的化療效果，糾正耐藥、改善患者生存質(zhì)量［10］。

PMA是K562中 p-ERK1/2的強(qiáng)效激活劑［10］。在本研究中，K562經(jīng)PMA刺激10 min后p-ERK1/2陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)。由于Ras/Raf/MEK/ERK和Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR信號通路能通過通路間的共同位點(diǎn)(如FLT3-ITD、Ras、CREB等)發(fā)生相互作用［10］，所以 K562 中 p-Akt T308、p-Akt S473 的表達(dá)也有不同程度的升高。通路激活增強(qiáng)后，DNR、Ara-C所誘導(dǎo)的 K562凋亡減少，提示 Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路與腫瘤細(xì)胞抗凋亡、耐藥有關(guān)，與文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致。

U0126是Ras/Raf/MEK/ERK通路中MEK的抑制劑，能阻止下游的ERKs將膜表面信號轉(zhuǎn)錄到胞內(nèi)，從而阻斷通路活化［10］。本研究中，抑制劑A組中p-ERK1/2表達(dá)下降，DNR誘導(dǎo)的K562凋亡率與對照組相比明顯增加，但Ara-C誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡率與對照組相近。LY294002是PI3K的抑制劑，能通過級聯(lián)反應(yīng)特異性抑制Akt的磷酸化［11］。我們采用LY294002作用K562后，細(xì)胞中p-Akt表達(dá)明顯降低，證明LY294002可以抑制p-Akt表達(dá)。DNR和Ara-C作用于抑制劑B組后，細(xì)胞凋亡率均較對照組明顯增加。雷帕霉素是mTOR抑制劑，它通過與FK506連接蛋白FKBP-12相結(jié)合，抑制下游轉(zhuǎn)錄因子作用的同時(shí)能反向抑制Akt，從而抑制因Ras/PI3K/PTEN/AKT/mTOR通路的異常激活［12，13］。但由于雷帕霉素是作用于 Akt下游的mTOR，所以本研究中我們未能檢測到p-Akt表達(dá)的下降。DNR和Ara-C分別作用后，抑制劑C組K562凋亡率較對照組均有所升高。上述結(jié)果說明，聯(lián)用Ras/PI3K/PTEN/AKT/mTOR通路抑制劑能增強(qiáng)白血病細(xì)胞對DNR和Ara-C的敏感性，抑制Ras/Raf/MEK/ERK通路能增強(qiáng)DNR的抗腫瘤效應(yīng)，但對Ara-C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用不明顯。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抑制Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路能提高ADM和紫杉醇等藥物對伴有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活的腫瘤的治療效果［6］。本研究中DNR作用后抑制劑A、B組的細(xì)胞凋亡率均較對照組增加，說明抑制 Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路能增強(qiáng)K562對DNR的敏感性。聯(lián)用Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR通路抑制劑也增強(qiáng)了Ara-C的抗腫瘤效應(yīng)。提示Ras/PI3K/PTEN/AKT/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路激活與腫瘤對蒽環(huán)類藥物耐藥的產(chǎn)生有關(guān)，聯(lián)用通路抑制劑不僅能糾正耐藥，還可降低化療藥使用劑量，從而減少化療相關(guān)不良反應(yīng)。但在本研究中，抑制K562Ras/Raf/MEK/ERK通路未能提高Ara-C的抗腫瘤效應(yīng)。這可能與K562對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑的敏感性有差異有關(guān)。

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