郭謙楠 張衛(wèi)華 廖世秀 王 莉 吳 東 侯巧芳 王應(yīng)太

(河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所，鄭州450003)

HLA即人類白細(xì)胞抗原(Human leucocyte antigen，HLA)，是具有高度多態(tài)性的同種異體抗原，存在于人體的各種有核細(xì)胞表面，能識別“自己”和“非己”，并通過免疫反應(yīng)排除“非己”，從而保持個體完整性。HLA分為Ⅰ類和Ⅱ類兩大類抗原。HLA-DQ基因位于第六號染色體短臂的p21.3區(qū)域中，屬于HLAⅡ類抗原，由α和β肽鏈組成，其中β肽鏈由HLA-DQB1基因所編碼。HLA的Ⅰ類A、B、C基因以及Ⅱ類DRB1基因多態(tài)性已被廣泛研究，并被證實其等位基因分布及頻率具有種族、地域的差異。HLA-DQB1在小規(guī)模人群中的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)DQB1基因多態(tài)性存在種族和地域的差異，但HLADQB1基因多態(tài)性在大規(guī)模人群中的調(diào)查并不多見，尤其是在河南這個人口大省還未見有報道［1-4］。在近幾年對中國人群HLA基因型與疾病的研究中發(fā)現(xiàn)DQB1基因多態(tài)性與反復(fù)性流產(chǎn)、天皰瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺疾病和肝癌的發(fā)生以及大腸癌化療副損傷存在顯著相關(guān)性［5-10］。因此，大規(guī)模健康人群DQB1基因多態(tài)性研究具有重要意義，可為以后進(jìn)行HLA基因型與疾病易感性的相關(guān)研究提供可靠的DQB1基因型參考數(shù)據(jù)，進(jìn)而可從遺傳免疫的角度來解釋某種疾病所存在的地域和種族差異。

1 材料與方法

1.1 材料 于2009年1月至2011年12月在河南省人民醫(yī)院進(jìn)行婚前檢查或孕前體檢且至少三代人均為長期居住在河南的河南籍漢族個體1 126名(563名男性和563名女性)，身體健康、無重大疾病史、相互之間三代以內(nèi)無血緣關(guān)系。采集其外周血各2 ml，EDTA抗凝。

1.2 方法

1.2.1 DNA的制備 應(yīng)用Tiangen公司的血液基因組提取試劑盒提取DNA，檢測DNA濃度在100～200 ng/μl，OD 值(260/280)大于1.65 小于1.9。

1.2.2 特異性PCR擴(kuò)增(PCR-SSP) 采用Invitrogen DRDQ2 Test SSP UniTray Kit低分檢測試劑盒并按照說明書操作對HLA-DQB1進(jìn)行基因分型。PCR擴(kuò)增循環(huán):96°C 60 秒 → (96°C 25 秒，70°C 50 秒，72°C 45秒) ×4 → (96°C 25 秒，65°C 50 秒，72°C 45秒) ×20 → (96°C 25 秒，55°C 60 秒，72°C 120秒)×3→ 保持12°C。

1.2.3 電泳檢測 用8μl擴(kuò)增產(chǎn)物在含有EB(10 mg/ml)的2.5%瓊脂糖凝膠上，145 V電壓電泳13分鐘后在全自動凝膠成像儀上拍照并觀測結(jié)果。

1.2.4 結(jié)果分析 利用試劑盒配套的分析軟件，將所觀察到的特異性擴(kuò)增帶所對應(yīng)的號碼輸入計算機(jī)，即可獲得HLA-DQB1的基因分型結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 直接計數(shù)分析等位基因頻率(GF):n/2N，n為某一等位基因在該群體中的個數(shù)，N為該群體的總?cè)藬?shù);應(yīng)用SPSS13.0對各等位基因型頻率數(shù)據(jù)進(jìn)行四表格的χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。樣本分布經(jīng)過Hardy-Weinberg平衡檢驗，P ＞0.05。

2 結(jié)果

檢測的1 126個樣本中共檢測出5種DQB1等位基因型。其中以 DQB1*03(39.65%)和 06(25.31%)為河南漢族人的優(yōu)勢基因型;DQB1*04(5.46%)基因型最少見。經(jīng)過統(tǒng)計分析，河南漢族人群DQB1*02-06等位基因型頻率與江蘇漢族人群相似(P＞0.05);河南漢族人群的 DQB1*02(16.30%)等位基因型頻率顯著高于湖北、昆明和深圳漢族人群;河南漢族人群的 DQB1*03(39.70%)等位基因型頻率顯著低于湖北和昆明漢族人群(P＜0.05);河南漢族人群的 DQB1*05(13.23%)等位基因型頻率顯著低于深圳漢族人群(P ＜0.05)。見表1。

表1 河南漢族人群與湖北、江蘇、昆明和深圳漢族人群DQB1位點多態(tài)性的比較Tab.1 The distribution analysis of DQB1 gene alleles between Henan，Hubei，Jiangsu，Kunming and Shengzhen Han population

3 討論

DQB1*02、03、04、05 和 06 五種等位基因型在已發(fā)表的對中國各民族人群調(diào)查的文獻(xiàn)報道中均存在［2，3，8，11，12］，但本次研究的結(jié)果表明這五種基因型頻率在不同地區(qū)漢族人群中又有所不同，各有各的特點。在河南漢族人群中，各等位基因型頻率由高到低依次為03＞06＞02＞05＞04，與江蘇人群一樣。在河南漢族人群中檢測到的最低頻率出現(xiàn)的DQB1*04基因型同樣為在湖北、江蘇和深圳三個地方檢測到的最低頻率出現(xiàn)的DQB1基因型，但在昆明人群中DQB1*02為最低頻率出現(xiàn)的DQB1基因型(表1);在河南、湖北、江蘇、昆明和深圳五個地區(qū)中，DQB1*03和06均為漢族人群中的優(yōu)勢基因型，但河南漢族人群的DQB1*03基因型頻率又與湖北和昆明存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，表明HLA-DQB1的各等位基因型分布不僅存在地域相似性也存在顯著的地域差異性。除此之外，在同為華中地區(qū)大省的河南與湖北的比較中，DQB1位點存在DQB1*02和03兩種等位基因型頻率的顯著差異(P＜0.05)，表明按中國地理劃分的華中地區(qū)進(jìn)行湖北、河南兩省DQB1位點多態(tài)性的合并研究并不十分科學(xué)，其合并統(tǒng)計的基因頻率數(shù)據(jù)不便當(dāng)作位于河南或湖北相應(yīng)地理區(qū)域內(nèi)省、市疾病研究的正常參考數(shù)據(jù)，或?qū)⒑幽匣蚝钡腄QB1各等位基因型頻率來代表整個華中地區(qū)，避免以偏蓋全。由此推出，以往簡單地將某個市區(qū)的HLA基因型分布作為某個地理區(qū)域的代表并不可取，在進(jìn)行DQB1基因多態(tài)性研究時最好先不要在一開始就把一個地理區(qū)域內(nèi)的幾個省或市合并統(tǒng)計研究。除此之外，不同民族間的DQB1等位基因型頻率又各不相同［1-3］。因此，在做疾病與 HLA-DQB1易感性研究時除了注意人種和民族的選擇，應(yīng)盡量選取正常對照人群與疾病組人群籍貫相同;有可能的話，各個省、市統(tǒng)計各自的HLA-DQB1位點多態(tài)性并公布，方便以后各個地區(qū)在做HLA-DQB1基因多態(tài)性與某種疾病相關(guān)性的研究時能夠更準(zhǔn)確地選取適當(dāng)?shù)娜巳鹤鳛檎φ毡苊廨^大的結(jié)果偏差。

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