金華良 羅清莉 厲 蓓 吳金峰 呂玉寶 杜文靜 徐海林 王根發(fā) 王 鎵 董競成

(復旦大學中西醫(yī)結(jié)合研究所華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海200040)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是氣道的一種慢性變態(tài)反應性疾病，氣道高反應是其顯著特征，氣道炎癥學說則是近年來公認最重要的發(fā)病機制之一。Th1/Th2失衡理論在哮喘氣道炎癥的作用已被廣泛認同［1］。但哮喘的發(fā)病機制十分復雜，并不能完全用此理論來解釋。Thl細胞并不一定起到保護性作用，有研究發(fā)現(xiàn)Th1型細胞因子IFN-γ可作用于肥大細胞上相應受體，加重氣道高反應性和氣道炎癥［2］。近年來研究認為調(diào)節(jié)性T細胞(簡稱Treg細胞)在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)及抑制炎癥方面起著重要作用，與哮喘氣道炎癥密切相關。Treg細胞可顯著抑制效應性T細胞活化和增殖，減少促炎因子的合成及降低IgE水平，從而減輕哮喘氣道炎癥和氣道高反應性［3，4］。CD4+CD25+Foxp3+是研究較為成熟的Treg細胞表型標記，F(xiàn)oxp3是其最特異性的轉(zhuǎn)錄因子，對Treg細胞分化成熟和功能的發(fā)揮具有重要意義［5］。但對于哮喘發(fā)病中 Treg細胞比例及Foxp3蛋白含量的變化，目前尚未完全闡述清楚。

本課題組既往研究證實補腎中藥淫羊藿可通過改善下丘腦-垂體-腎上腺軸功能，促進內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素釋放，從而控制哮喘氣道炎癥［6，7］。淫羊藿苷是淫羊藿主要的有效成分，我們前期研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以有效抑制哮喘模型氣道炎癥［8］。但淫羊藿苷是否對Treg細胞及Foxp3蛋白有調(diào)節(jié)作用，從而抑制氣道炎癥，目前尚未了解。本研究通過檢測哮喘模型氣道炎癥水平及氣道高反應性，脾臟Treg細胞比例和Foxp3平均熒光強度，以及肺組織Foxp3蛋白表達量的變化，并觀察淫羊藿苷的干預作用，探討淫羊藿苷對哮喘氣道炎癥和氣道高反應性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康6周齡BALB/c小鼠32只(體重16～18克)，上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供。將動物隨機分為4組:正常對照組、哮喘模型組、淫羊藿苷組和地塞米松組，每組8只。淫羊藿苷，由成都曼斯特生物科技有限公司提供;地塞米松，由西安博森生物制藥有限責任公司提供。卵蛋白(Ⅱ級)、氫氧化鋁和乙酰甲膽堿:均購于美國Sigma公司;小鼠調(diào)節(jié)T細胞檢測試劑盒(Mouse Regulatory T Cell Staining Kit#1)，及大鼠抗小鼠Foxp3單克隆抗體均購于美國 ebioscience(San Diego，USA)公司;IL-10酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定試劑盒:購于上海西塘生物醫(yī)藥公司;小鼠有創(chuàng)肺功能儀:美國buxco公司產(chǎn)品;流式細胞儀:美國BD公司產(chǎn)品;超聲霧化器:上海魚躍醫(yī)療設備有限公司產(chǎn)品，型號:402AI。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備 造模方法參照文獻并加以改進［9］。哮喘組:于實驗第0天和第14天腹腔內(nèi)注射致敏液0.5 ml(含卵蛋白100μg和氫氧化鋁干粉5 mg)，第21天起用1%的卵蛋白生理鹽水溶液霧化吸入激發(fā)，隔天1次，每次30分鐘，連續(xù)2周。淫羊藿苷和地塞米松治療組:哮喘小鼠動物模型的建立同哮喘組，并從第21天起于每次激發(fā)前1小時灌胃給藥，分別給予淫羊藿苷組50 mg/kg，地塞米松1 mg/kg，每天1次，連續(xù)2周至處死。正常對照組:用等量生理鹽水代替卵蛋白進行腹腔注射和霧化吸入。

1.2.2 氣道高反應性檢測 通過Buxco公司有創(chuàng)肺功能儀直接測定氣道阻力(airway resistance，RL)反映小鼠的氣道反應性。小鼠在末次激發(fā)24小時后，腹腔注射戊巴比妥鈉70 mg/kg麻醉。將麻醉后的小鼠行氣管切開術后插管，放入密閉體描箱內(nèi)，呼吸機輔助通氣。等小鼠氣道阻力基線穩(wěn)定后，測定10μl倍增濃度的乙酰甲膽堿霧化激發(fā)后小鼠RL的變化，每次霧化10秒，記錄3分鐘。激發(fā)濃度由低到高，依次為 0、3.12、6.25、12.5 mg/ml。以各濃度RL原始值變化來評估小鼠氣道反應性。

1.2.3 血清、肺泡灌洗液(BALF)采集和IL-10測定 采用摘眼球取血，放于無菌離心管中，然后在常溫下靜置2小時后，4℃，3 000 r/min，離心10分鐘，收集上部血清，棄沉淀，-80℃保存。BALF收集通過夾閉右主支氣管，用相應導管插入左主氣管內(nèi)，緩緩注入0.5ml生理鹽水，反復灌洗左肺3次，回收率在80%左右。將回收的BALF在4℃，3 000 r/min下，離心10分鐘，上清液保存于 -80℃。血清和BALF上清液IL-10的測定采用ELISA法，檢測過程按生產(chǎn)廠商提供的操作說明進行。

1.2.4 肺組織HE染色 取右肺上葉，10%的中性福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，厚4μm，行蘇木精-尹紅(HE)染色，光鏡下觀察小鼠支氣管粘膜下和周圍肺組織炎性細胞浸潤。參照文獻［10］，對炎癥浸潤程度進行評分:0，沒有炎癥細胞;1，少量炎癥細胞;2，炎癥細胞形成環(huán)狀，層厚為1個細胞;3，炎癥細胞形成環(huán)狀，層厚為2～4個細胞;4，炎癥細胞形成環(huán)狀，層厚＞4個細胞。

1.2.5 流式細胞術 無菌取脾，用彎剪將脾臟剪成小塊，加入1640培養(yǎng)基制成細胞懸液，用淋巴細胞分離液分離后取白霧層，洗滌，1 500 r/min，5分鐘離心沉淀后PBS重懸，細胞計數(shù)，配成每EP管1×106個細胞，加入相應的熒光標記單抗(anti-CD4-FITC、anti-CD25-APC)，輕輕混勻，冰上避光孵育30分鐘。用流式細胞染色緩沖液洗滌后，加入1 ml細胞固定和破膜液，冰上避光孵育30分鐘。破膜緩沖液洗滌2次，加入anti-Foxp3-PE，冰上避光孵育60分鐘，用破膜緩沖液洗滌2次，300μl PBS重懸。以上操作參照說明書進行。數(shù)據(jù)分析:采用Flowjo軟件，計算CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在脾臟淋巴細胞中的百分率，以及Treg細胞Foxp3平均熒光強度，以平均熒光強度作為蛋白的相對表達量。

1.2.6 Western blot檢測 取肺組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每組取50μg的總蛋白，按1∶4加入5×SDS上樣緩沖液，沸水浴中加熱5分鐘，然后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉1小時，分別加入 Foxp3(1∶250)和內(nèi)參 GAPDH(1∶1 000)一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)，室溫與膜孵育1小時，TBST洗滌3次，ECL法曝光后洗片，掃描后用Quantity One灰度分析軟件進行光密度計算，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為相應目的蛋白的表達量指標。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)采用±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Dunnett法，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 氣道高反應檢測結(jié)果Fig.1 Measurement of airway hyperresponsiveness

2 結(jié)果

2.1 氣道反應性測定 各組小鼠的基礎RL無顯著差異，乙酰甲膽堿以3.125 mg/ml劑量激發(fā)時各組比較氣道阻力(RL)無顯著差異(P ＞0.05)。乙酰甲膽堿以6.25和12.5 mg/ml劑量激發(fā)時，與正常組比較:哮喘模型組RL顯著升高(P ＜0.05);與模型組比較:淫羊藿苷及地塞米松組RL均顯著降低(P ＜ 0.05)，見圖1。

2.2 肺組織病理結(jié)果 正常對照組支氣管管腔光滑，氣道黏膜無明顯水腫，肺泡間隔正常，氣道及肺泡見少量炎性細胞浸潤;哮喘模型組可見大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔增厚，氣道平滑肌增生變厚;地塞米松組及淫羊藿苷組氣道壁炎性細胞浸潤程度明顯降低。與正常組比較:模型組氣道炎癥評分顯著升高(P ＜0.05);與模型組比較，淫羊藿苷組及地塞米松組氣道炎癥評分顯著減輕(P ＜0.05)，見圖2。

2.3 脾CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例及Foxp3平均熒光強度 與正常組比較:模型組脾CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例無顯著差異(P＞0.05)，但 Foxp3平均熒光強度顯著下降(P＜0.05);與模型組比較:地塞米松及淫羊藿苷組脾CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞有升高趨勢，但無顯著差異(P＞0.05)，地塞米松組Foxp3平均熒光強度顯著升高(P＜0.05)，淫羊藿苷組較模型組無顯著差異(P ＞ 0.05)，見表1和圖3。

圖2 各組肺組織病理變化(HE染色，×100倍)及炎癥評分Fig.2 Histological analysis by HE staining( ×100)and airway inflammation score

表1 各組脾Treg細胞比例(%，±s)Tab.1 Frequencies of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in spleen detected by FCM(%±s)

表1 各組脾Treg細胞比例(%，±s)Tab.1 Frequencies of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in spleen detected by FCM(%±s)

Note:Vs asthma group，1)P ＜0.05.

Groups Treg MFI(Foxp3)Normal 8.05 ±1.14 73.03 ±11.411)Asthma 8.52 ±0.92 54.4 ±5.05 Icariin 9.25 ±0.98 63 ±5.51 DEX 9.76 ±1.64 70.08 ±14.001)

圖3 各組Treg細胞流式檢測圖Fig.3 Representative plots of FCM are from a single rat in each group

2.4 肺組織中Foxp3的蛋白含量 Westem blot結(jié)果顯示，與正常組比較:哮喘組肺組織Foxp3蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05);與模型組比較，淫羊藿苷組和地塞米松組Foxp3表達量均顯著升高(P ＜ 0.05)，見圖4。

2.5 肺泡灌洗液及血清IL-10 各組肺泡盥洗液(BALF)IL-10無明顯差異(P＞0.05);與正常組比較:模型組血清IL-10顯著下降;與模型組比較:淫羊藿苷組及地塞米松組血清IL-10水平均顯著升高(P ＜0.01，P ＜0.05)，見表2。

3 討論

圖4 Foxp3的蛋白在肺組織中的Western blot檢測Fig.4 The expression of Foxp3 protein in lung tissues by Western blot

表2 BALF及血清IL-10水平(%，x±s)Tab.2 The levels of IL-10 in BALF and serum(%，x±s)

本實驗發(fā)現(xiàn)哮喘脾Treg細胞比例與正常組無顯著差異，這與既往報道類似［11］。有研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血CD4+CD25high和CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞比例較正常人群無顯著差異［12］。這提示哮喘肺外組織Treg細胞比例可能無顯著變化。本實驗未測肺組織或BALF中Treg細胞比例，是局限所在。但既往已證實哮喘小鼠肺組織Treg細胞絕對數(shù)量增加，相對比例較正常組顯著下降［13］。而臨床研究則發(fā)現(xiàn)輕度哮喘患者其BALF中Treg細胞數(shù)量與正常人群無顯著差異，當哮喘急性發(fā)作后，BALF中Treg細胞數(shù)量顯著升高，但外周血Treg細胞數(shù)量無顯著變化［14］，這說明哮喘Treg細胞比例或數(shù)量與所檢測部位以及哮喘嚴重程度密切相關。

Treg細胞分化成熟過程和功能很大程度上與轉(zhuǎn)錄因子Foxp3相關，減少或移除Foxp3可導致Treg細胞功能下降，而Foxp3移入CD25-的效應性T細胞可使后者具有免疫抑制功能［15］，提示Foxp3對于Treg細胞功能發(fā)揮至關重要。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠Foxp3蛋白在脾Treg細胞中表達量顯著減少，在肺組織中卻顯著升高。既往報道也支持了本研究結(jié)果:Provoost等［12］發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血Treg細胞數(shù)量與正常者無顯著區(qū)別，但Treg細胞Foxp3蛋白表達顯著下降;而Smyth等［16］發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液中Treg細胞數(shù)量和Foxp3表達量均較正常組顯著升高。哮喘肺和肺外組織Foxp3蛋白表達存在差異，其機制尚未明確，可能和氣道炎癥相關。研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者急性發(fā)作后，氣道炎癥加劇的同時BALF中Treg細胞數(shù)量顯著升高［14］，說明哮喘肺內(nèi)Foxp3蛋白表達的升高可能與氣道炎癥時Treg細胞數(shù)量的增加相關。在哮喘發(fā)病過程中，傳統(tǒng)效應性T細胞大量增殖，同時Th2細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3表達亦顯著升高［8］。故而哮喘肺組織中盡管Foxp3蛋白絕對數(shù)量增加，其相對于GATA-3水平可能是下降的，以上提示哮喘肺或肺外組織Foxp3蛋白都存在絕對或相對不足。

糖皮質(zhì)激素對哮喘慢性氣道炎癥和氣道高反應性均有很好的改善作用，其機制也與上調(diào)Treg細胞數(shù)量及Foxp3水平相關［17］。但長期使用激素仍存在一定的副作用，如抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸，導致內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素分泌下降，以及產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素抵抗等［18］。故而從祖國中醫(yī)藥中開發(fā)出有效藥物具有顯著臨床意義。本實驗在前期研究的基礎上［8］，進一步證實了淫羊藿苷對哮喘氣道炎癥和氣道高反應性干預作用。淫羊藿苷的作用機制目前尚未闡明，本研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可上調(diào)哮喘肺內(nèi)Foxp3蛋白的表達，但脾Foxp3平均熒光強度無顯著變化，這提示淫羊藿苷對哮喘單個 Treg細胞Foxp3表達無顯著影響，其可能主要通過促進肺內(nèi)Treg細胞的增加，從而使Treg細胞表達Foxp3蛋白總量增加。如上所述，F(xiàn)oxp3表達水平與Treg細胞功能密切相關，而Treg細胞具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制Th1、Th2、Th17等效應性細胞介導的免疫反應，對控制哮喘氣道炎癥發(fā)揮重要作用［19］。故而淫羊藿苷對哮喘氣道高反應和氣道炎癥的改善作用可能和其上調(diào)肺內(nèi)Foxp3蛋白水平相關。

此外，令人奇怪的是，我們發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷比地塞米松可更好地增加外周血IL-10水平。IL-10是一種抑炎因子，研究表明其可減少氣道內(nèi)嗜酸粒細胞，肥大細胞等炎癥細胞數(shù)量，抑制IgE分泌，改善哮喘氣道炎癥及氣道高反應性［20］。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠血清IL-10顯著下降，而肺泡灌洗液各組間IL-10無顯著差異。既往有研究提示哮喘模型血清和肺泡灌洗液 IL-10 均較正常組下降［21，22］，也有報道哮喘患者急性發(fā)作時，肺泡灌洗液IL-10顯著增加［16］。研究表明Tr1調(diào)節(jié)T細胞，Th3調(diào)節(jié)T細胞，Th2細胞以及髓樣樹突狀細胞等都可分泌IL-10，IL-10來源多樣性可能是報道差異的重要原因。但鑒于IL-10可減輕哮喘氣道炎癥，淫羊藿苷增加IL-10水平可能也與其抗炎機制相關。

綜上，本實驗通過觀察哮喘小鼠Treg細胞及Foxp3蛋白的變化，以及淫羊藿苷的干預作用，提示哮喘脾Treg細胞Foxp3蛋白表達下降，淫羊藿苷可能通過調(diào)節(jié)肺內(nèi)Foxp3蛋白表達水平，增加外周血IL-10水平，從而改善哮喘氣道炎癥和氣道高反應性。

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