許國(guó)青 王曉琴 崔佳穎 李萬(wàn)強(qiáng)

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生干部教育培訓(xùn)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031;2.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

黃花列當(dāng)(Orobanche pycnostachya Hance)為列當(dāng)科(Orobanche)列當(dāng)屬植物，為多年生、二年生或一年生寄生草本，主要寄生于蒿屬植物的根上［1］。全草入藥，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)、強(qiáng)筋骨的功能，用于治療腰膝冷痛、陽(yáng)痿、遺精，蒙醫(yī)藥還用于治療碳疽，民間常做肉蓯蓉的代用品［2］。

本文首次研究了黃花列當(dāng)70%乙醇粗提物和不同萃取部位對(duì)［DPPH·］自由基的清除作用。自由基包括活性氧類，存在于體內(nèi)外，是生物體正常代謝中形成的，影響著各種生理活性。生物體內(nèi)過(guò)量的氧自由基會(huì)導(dǎo)致一系列疾病，如血管粥樣硬化、高血壓、糖尿病、癌癥、帕金森病及老年癡呆癥等。所以能消除活性氧的抗氧化劑受到了人們更多的關(guān)注。一些蒙醫(yī)藥藥治病的機(jī)理也被認(rèn)為與其抗氧化活性有密切關(guān)系。

DPPH(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)通常被用來(lái)檢測(cè)抗氧化劑的抗氧化活性［3-6］。［DPPH·］是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，它的穩(wěn)定性主要來(lái)自共振穩(wěn)定作用及3個(gè)苯環(huán)的空間障礙，而使夾在其中氮原子上的不成對(duì)電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對(duì)作用。［DPPH·］在517nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收峰，溶液呈紫色，其濃度與吸光度呈線性關(guān)系。當(dāng)在溶液中有自由基清除劑存在時(shí)，清除劑提供的質(zhì)子會(huì)和［DPPH·］結(jié)合形成［DPPH·-H］或發(fā)生替代，使［DPPH·］自由基數(shù)量減少，從而使溶液顏色由紫色變?yōu)辄S色，表現(xiàn)為在517nm處的吸光度不斷減小。借此可以用來(lái)表征某種物質(zhì)對(duì)自由基的清除能力。一般用IC50值來(lái)評(píng)價(jià)此物質(zhì)抗氧化活性的大小。IC50值越小，表示該物質(zhì)清除［DPPH·］性越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)研究了黃花列當(dāng)對(duì)［DPPH·］自由基的清除作用，為其進(jìn)一步深入研究利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑:黃花列當(dāng)藥材于2010年3月購(gòu)自內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)院蒙藥房;自由基DPPH(Sigma Aldrich公司生產(chǎn));抗壞血酸(天津市科盟化工工貿(mào)有限公司);所用溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備:OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化);KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器〔昆山市超聲儀器有限公司);TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);DGG-9070B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱;電子天平(YP5001N);分析天平(梅特勒 -托利多AL204);凍干機(jī)(基因有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取部位制備:干燥的黃花列當(dāng)4 kg粉碎，70%乙醇回流提取2次，合并藥液，回收乙醇，得到70%乙醇總提物(hh4)，浸膏加入適量水混懸，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，揮干，得乙酸乙酯部位(hh1)浸膏146.9g、正丁醇部位(hh2)浸膏185.5g和水(hh3)部位420.8g。4部位樣品均取部分冷凍干燥，備用。

2.2 溶液配制

2.2.1 ［DPPH·］溶液的配制:精確稱取 DPPH 粉末2.0 mg，用乙醇溶解，定容，配成 0.01mg·mL-1的 DPPH 無(wú)水乙醇溶液，置于冰箱內(nèi)在4℃下避光保存，待用。

2.2.2 對(duì)照品 Vc的配制:精確稱取 Vc粉末2.5mg，用乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶?jī)?nèi)，定容，搖勻得質(zhì)量濃度為0.05 mg·mL-1的 Vc 對(duì)照品溶液;依次稀釋為 0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1的溶液;置于冰箱內(nèi)在4℃下避光保存，待用。

2.2.3 樣品溶液的配制:精密稱取約 2.5mg的 hh1、hh2、hh3和 hh4凍干粉末，分別用乙醇溶解后，配成0.05mg·μmL-1的溶液;依次稀釋為 0.01mg·μmL-1、0.02mg·μmL-1、0.03mg· μmL-1、0.04mg· μmL-1、0.05mg·μmL-1的溶液;置于冰箱內(nèi)在4℃下保存，待用。

2.3 清除［DPPH·］自由基能力的測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品Vc的測(cè)定:吸取無(wú)水乙醇0.1mL與4.9mL的［DPPH·］溶液(0.01mgμmL-1)在試管中混合，搖勻后迅速倒入石英吸收池中，以無(wú)水乙醇作空白，立即用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在517nm處測(cè)定吸光度，此時(shí)的數(shù)據(jù)為Aj。

依次吸取質(zhì)量濃度為 0.01 mg·mL-1、0.02mg·μmL-1、0.03mg·μmL-1、0.04mg·μmL-1和 0.05mg·μmL-1的Vc 對(duì)照品溶液0.1ml分別與4.9ml［DPPH·］溶液(0.01mg·μmL-1)在試管中混合，搖勻后迅速倒入石英吸收池中。以0.1mLVc對(duì)照品溶液和4.9mL無(wú)水乙醇的混和后作空白，立刻用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在517nm處測(cè)定吸光度，第 0、1、2、3、4、5min 分別測(cè)一次吸光度(若每分鐘吸光度值改變不超過(guò)0.003個(gè)單位則停止測(cè)量)，之后每隔5min測(cè)一次吸光度，直到30min時(shí)結(jié)束，此時(shí)的數(shù)據(jù)為Ai。

2.3.2 樣品的測(cè)定:分別依次吸取質(zhì)量濃度為0.01mg·μmL-1、0.02mg· μmL-1、0.03mg· μmL-1、0.04mg·μmL-1和 0.05mg·μmL-1的 hh1、hh2、hh3、hh4 樣品溶液按上述方法與DPPH反應(yīng)，并測(cè)定Ai。

2.3.3 計(jì)算清除率:按公式計(jì)算對(duì)照品和各樣品對(duì)［DPPH·］自由基的清除率(I)。

I=［1-(Ai/Aj)］ ×100%

3 結(jié)果與討論

以清除率(%)為縱坐標(biāo)，樣品溶液的質(zhì)量濃度(mgμmL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IC50(mgμmL-1)值。結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

圖1 彎管列當(dāng)各提取部位對(duì)DPPH·的清除能力

表1 黃花列當(dāng)各提取部位對(duì)DPPH·的清除作用

由圖1、表1可知，黃花列當(dāng)4個(gè)組分對(duì)DPPH·的清除能力隨各組分濃度的增大而增強(qiáng)。從回歸方程得各組分的IC50值(mgμmL-1)從小到大依次為:對(duì)照品 Vc(0.0718)＜乙酸乙酯部位(0.0997)＜正丁醇部位(0.1284)＜70%乙醇總提物(0.1732)＜水部位(0.4538)。

以維生素C作為對(duì)照品，結(jié)合［DPPH·］法評(píng)價(jià)黃花列當(dāng)提取物的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃花列當(dāng)各萃取組分都具有不同程度的抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位的清除［DPPH·］自由基活性最強(qiáng)，正丁醇部位也有較好的清除［DPPH·］自由基活性，水部位的清除［DPPH·］自由基能力較弱。這個(gè)結(jié)果初步證實(shí)傳統(tǒng)藥物黃花列當(dāng)具有很強(qiáng)的抗氧化活性，應(yīng)用前景十分廣闊，為蒙醫(yī)臨床提供了有力證據(jù)。

［1］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，1990，69:113-114.

［2］內(nèi)蒙古植物藥志編輯委員會(huì).內(nèi)蒙古植物藥志，第五卷［M］.呼和浩特:內(nèi)蒙古人民出版社，1980:311.

［3］曲歡歡，李白雪，燕菲，等.用清除有機(jī)自由基DPPH法評(píng)價(jià)連翹不同部位抗氧化作用［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2008，15(增):32-34.

［4］王晶，李麗，劉春明，等.不同紅藥提取物中總酚的測(cè)定及抗氧化活性的DPPH法評(píng)價(jià)研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(3):513-515.

［5］關(guān)立立，侯微，金銀萍，等.干玉竹根與鮮玉竹根萃取組分清除DPPH·活性比較［J］.特產(chǎn)研究，2011，(1):42-58.

［6］袁亞男，陳承瑜，楊濱，等.31種黃酮、酚酸類化合物和10種中藥清除 DPPH能力考察［J］.中國(guó)中藥雜志，2009，34(13):1695-1700.