劉永喜

(內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065)

小白蒿，別名冷蒿，蒙名阿給，系菊科蒿屬植物冷蒿Artemisia frigida Willd.的地上部分，具有止血、消腫、制伏癰疽等功能，是民間和蒙醫(yī)臨床主治各種出血病的常用藥材［1］。最早《四部醫(yī)典》有記載“止血選用小白蒿炭”。

蒙醫(yī)一直都有阿給煅炭止血的應(yīng)用，而且取得了顯著的成效。崔箭［2］等將蒙藥阿給制炭后用于支氣管擴(kuò)張咯血的治療，取得了確切的療效。田華詠［3］的《中國(guó)民族藥炮制集成》中提出阿給制炭的炮制方法為:取凈藥材，置鍋內(nèi)，明火炒至黑色或炭時(shí)，取出，放涼。謝坤［4］等運(yùn)用磷鉬鎢酸－干酪素法建立了阿給生藥及炭藥中鞣質(zhì)含量測(cè)定方法，阿給制炭后鞣質(zhì)含量明顯降低。張婉［5］等采用紫外分光光度法測(cè)定阿給生藥及炭藥中總黃酮的含量，結(jié)果生藥中總

黃酮含量約為炭藥的2倍。由此說(shuō)明小白蒿炭的止血作用并不與鞣質(zhì)和總黃酮含量呈平行關(guān)系，而可能與炒炭過(guò)程中原有成分的比例改變，或者產(chǎn)生了新的成分，如止血與抗止血成分比例的變化及炭素的產(chǎn)生等有關(guān)。大量研究表明，炭藥止血不僅與鞣質(zhì)含量有關(guān)而且與可溶性鈣離子、止血抗止血成分及炭素等因素有關(guān)［6］。另外，文獻(xiàn)［7］報(bào)道有些黃酮類化合物也具有止血的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用 L9(34)正交試驗(yàn)法，以5，7，3'－ 三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮、5，3'－二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮和鞣質(zhì)在炮制過(guò)程中的變化為考察指標(biāo)，對(duì)小白蒿炭的炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器:UV－3000型雙波長(zhǎng)/雙光束紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);高效液相色譜儀(LC10－Atvp輸液泵，SPD－M10Avp檢測(cè)器，SCL－10Avp工作站，DGU－12A脫氣機(jī));AUW220D型自動(dòng)電子天平(日本島津公司);KQ－100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SYZ－A型石英亞沸高純水蒸餾器(江蘇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)

1.2 試藥:鞣酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，編號(hào):110831 －200302);5，7，3'－三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮和5，3'－二羥基－6，7，4'－三甲氧基黃酮均自制。大孔樹脂D101(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司);硅膠G(上海海洋化工廠);乙腈和甲醇為色譜純(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材:實(shí)驗(yàn)中所用的小白蒿采集地點(diǎn)為內(nèi)蒙古通遼市扎魯特旗罕山，并經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥生藥教研室主任布和巴特爾鑒定為菊科蒿屬植物冷蒿Artemisia frigida Willd.的地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):錢云川［8］“中藥炒炭質(zhì)量控制”論文中指出，炒炭質(zhì)量控制要點(diǎn)是控制火候掌握溫度、每次入鍋量和炒炭程度。這充分說(shuō)明炒炭炮制過(guò)程中主要影響因素是溫度、藥材量和時(shí)間。以小白蒿的傳統(tǒng)炮制工藝為參照，同時(shí)結(jié)合預(yù)試驗(yàn)，確定影響小白蒿炭炮制工藝的主要因素為炒炭溫度(A)、炒炭時(shí)間(B)及藥材重量(C)，采用正交試驗(yàn)對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素?cái)M定3個(gè)水平，見(jiàn)表1。按表L9(34)安排進(jìn)行試驗(yàn)，共炒制得9份小白蒿炭樣品，待用。1－9號(hào)樣品段長(zhǎng)均約為10mm，顏色見(jiàn)表2。

表1 因素水平表

表2 成品性狀表

2.2 鞣質(zhì)含量測(cè)定

2.2.1 鞣酸儲(chǔ)備液的制備:精密稱取鞣酸對(duì)照品20.00mg于10mL棕色容量瓶中，加30%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液的制備:取小白蒿炭粉末0.5g，精密稱定，置具塞棕色錐形瓶中，精密加入30%甲醇25.00mL，浸泡24h，過(guò)濾，棄去初濾液5mL，精密吸取續(xù)濾液2mL，置50mL棕色容量瓶中，加30%甲醇定容至刻度，搖勻，既得供試品溶液。

2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)選擇:吸取對(duì)照品溶液和小白蒿炭供試液適量置石英比色皿中，在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 小白蒿炭供試液和鞣酸對(duì)照液UV掃描圖(A、小白蒿炭供試液;B、鞣酸對(duì)照液)

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密吸取鞣酸儲(chǔ)備液的制備液適量，分別置25ml棕色容量瓶中，加30%甲醇至刻度，搖勻，既得不同濃度系列對(duì)照品溶液。以相應(yīng)的試劑為空白，在276nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程式為y=0.043x+0.0863(r=0.9993)，線性范圍為 2.00 ～22.00'g.mL－1。

2.2.4.2 精密度試驗(yàn):取3號(hào)對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果的RSD為1.08%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn):取6號(hào)供試液適量，在12h內(nèi)，每隔一定時(shí)間測(cè)定1次，共測(cè)6次。結(jié)果RSD為1.36%。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn):取6 號(hào)樣品，每份 0.5g，共 6 份，按供試品溶液法制備，含量測(cè)定項(xiàng)下操作。結(jié)果的RSD為1.52%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.4.5 加樣回收試驗(yàn):取 6號(hào)樣品粉末 0.25g，共 6份，分別加入鞣酸對(duì)照品適量，按供試品溶液方法制備，含量測(cè)定項(xiàng)下操作，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 樣品含量測(cè)定:分別精密吸取供試液1mL，置25mL棕色容量瓶中，加30%甲醇至刻度。在276nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算結(jié)果。

2.3 黃酮含量測(cè)定

2.3.1 提取溶劑的選擇和預(yù)處理:稱取6號(hào)樣品3份，每份為0.1g，精密稱定，以氯仿、氯仿:甲醇(1:1)、甲醇為溶劑，分別加20mL，超聲處理30min，濾過(guò)。分別吸取濾液10mL，放入已裝好40g大孔樹脂(D101)的色譜柱，先用20%乙醇溶液50mL洗脫，然后用無(wú)水乙醇100mL洗脫。把無(wú)水乙醇部分減壓回收至干，加色譜乙腈溶解并定容至10ml容量瓶中。在實(shí)驗(yàn)所用的色譜條件下，測(cè)定色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氯仿的提取率與其他兩種溶劑的相當(dāng)，并且預(yù)處理后的色譜峰清晰，分離度較好。預(yù)處理中先用20%的乙醇50mL洗脫，兩種成分均沒(méi)有洗脫下來(lái)。然后用無(wú)水乙醇100mL洗脫，不僅兩種成分均完全洗脫下來(lái) ，而且與其他雜質(zhì)分離。選定氯仿為提取溶劑，預(yù)處理方法為先用20%乙醇溶液50mL洗脫，然后用無(wú)水乙醇100mL洗脫。

2.3.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):色譜柱:大連依利特hypersil ODS2 柱 (200mm × 4.6mm，5μm);檢 測(cè) 波 長(zhǎng)274nm，流動(dòng)相:乙腈－0.2%磷酸溶液，梯度洗脫;流速1.0mL.min－1，記錄色譜圖時(shí)間40min;進(jìn)樣量:20'L。在上述色譜條件下，5，7，3'－三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮(1)，5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮(2)達(dá)到基線分離(R＞1.5)，理論塔板數(shù)均不低于3500，結(jié)果見(jiàn)圖2.

圖2 小白蒿炭供試液和混合對(duì)照品溶液色譜圖(A、混合對(duì)照品溶液;B、小白蒿炭供試液)

2.3.3 線性關(guān)系考察:精密稱取 5，7，3'－ 三羥基 －6，4'－二甲氧基黃酮(1)，5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮(2)適量，加色譜乙腈溶解并配成濃度為1mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別用色譜乙腈配成不同濃度的系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件和方法分析測(cè)定，以對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程式，分別為y=1.229×105x－4444(r=0.9991)，線性范圍為 5.00 ～40.00g.mL－1;y=2.527 ×105x－3111(r=0.9999)，線性范圍為 2.00 ～40.00g.mL－1。

2.3.4 精密度試驗(yàn):分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別用色譜乙腈稀釋至6μg/ml對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下，進(jìn)樣量20μL，進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積，計(jì)算RSD值分別為 1.98%和 1.02%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取6號(hào)供試液20μl，注入色譜儀，在24h內(nèi)每隔一定時(shí)間測(cè)定1次，進(jìn)行穩(wěn)定性考察。在24h內(nèi)測(cè)定5次，數(shù)據(jù)穩(wěn)定。5，7，3'－三羥基 －6，4'－二甲氧基黃酮(1)，5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮(2)的RSD分別為1.20%和1.12%。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn):取6號(hào)供試品6份，精密稱定，按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，5，7，3'－ 三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮(1)，5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮(2)的 RSD分別為1.18%和1.73%。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn):取6號(hào)樣品粉末0.05g，共6份，分別加入5，7，3?－三羥基 －6，4'－二甲氧基黃酮(1)，5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮(2)對(duì)照品適量，按供試品溶液方法制備，含量測(cè)定項(xiàng)下操作，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3.8 含量測(cè)定:分別稱取不同樣品的小白蒿0.1g，精密稱定，加氯仿20ml，超聲處理30min，濾過(guò)。分別吸取濾液10mL，蒸干，加20%甲醇10mL，溶解后放入已裝好40g大孔樹脂(D101)的色譜柱，先用20%乙醇溶液50mL洗脫，然后用無(wú)水乙醇100mL洗脫。把無(wú)水乙醇部分減壓回收至干，加色譜乙腈溶解并定容至25ml，既得樣品供試液。分別精密吸取樣品供試液20μL，注入色譜儀，掃描，測(cè)定，計(jì)算其含量。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果:結(jié)果見(jiàn)表5。從表5的直觀分析及表6～表8的方差分析結(jié)果可以得出:影響鞣質(zhì)的因素依次為，A＞B＞C，最佳搭配為A1B1C2，但在此條件下制得的飲片性狀不符和藥典規(guī)定。影響5，7，3'－三羥基－6，4'－二甲氧基黃酮的因素依次為，A＞B＞C，最佳搭配為A1B1C3，但在此條件下制得的飲片性狀與A1B1C2相近。影響5，3'－二羥基－6，7，4'－三甲氧基黃酮的因素依次為，A＞B＞C，最佳搭配為A3B3C1，而在此條件下得到的飲片不能保持原生藥形態(tài)而且部分變成灰分。因此，綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)成本、效率及正交試驗(yàn)結(jié)果等因素，選定炒小白蒿的最佳工藝為:A2B2C2。

表5 L9(34)正交試驗(yàn)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 鞣質(zhì)方差分析表

表7 5，7，3'－三羥基－6，4'－二甲氧基黃酮方差分析表

表8 5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮方差分析表

2.5 小白蒿炭炮制工藝驗(yàn)證與生藥比較

2.5.1 炮制工藝驗(yàn)證:按照優(yōu)化工藝進(jìn)行小白蒿炒炭炮制工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)，即取小白蒿40g，炒炭溫度為220℃，炒炭的時(shí)間為20 min，炮制成小白蒿炭。分別對(duì)3批小白蒿炭中鞣質(zhì)、5，7，3'－ 三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮和 5，3'－二羥基－6，7，4'－三甲氧基黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果分別為 7.18、2.38 和 2.54mg.g－1。

2.5.2 與生藥比較

2.5.2.1 鞣質(zhì)含量比較:稱取小白蒿6 份，每份0.5g，精密稱定，照“2.2.2”項(xiàng)下制備供試液，在“2.2.5”項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為14.084mg.g－1。小白蒿制炭后鞣質(zhì)含量明顯降低。

2.5.2.2 黃酮的比較:稱取小白蒿6 份，每份0.1g，精密稱定，照“2.3.8”項(xiàng)下制備供試液并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果 5，7，3'－三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮和 5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－三甲氧基黃酮的含量分別為 6.53 和 1.09 4mg.g－1，色譜圖見(jiàn)3。從圖3可知，小白蒿炭和生藥色譜圖不一致，有的峰減弱甚至消失，有的峰增強(qiáng)乃至出現(xiàn)與生藥不同的色譜峰。

圖3 小白蒿炭和生藥色譜圖

3 討論

3.1 在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)考慮到小白蒿炒炭的傳統(tǒng)工藝中常用鐵鍋，而鐵元素對(duì)人體影響較小，又適合工廠生產(chǎn)，且成本較低，故確定鍋的品質(zhì)為鐵鍋。

3.2 全草類藥物炒至焦褐色，仍保持原生藥形態(tài)為度，如果炒成炭黑色就太過(guò)了［9］;每次入鍋量以鍋容量30% ～50%為宜，過(guò)多則難以翻炒均勻。故我們通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了炒炭溫度、炒炭時(shí)間及藥材重量等因素的3個(gè)水平。

3.3 本實(shí)驗(yàn)鞣質(zhì)含量測(cè)定時(shí)，藥材與對(duì)照品進(jìn)行了UV掃描，在300～400nm區(qū)域內(nèi)藥材有一個(gè)吸收帶外，200～300nm內(nèi)藥材與對(duì)照品的峰位和峰形比較相似，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)(276nm)處對(duì)藥材作了吸收度和濃度曲線，其線性良好(r=0.9994)，說(shuō)明在276nm處測(cè)定具有可行性。此外，考察了水、10%甲醇、30%甲醇和50%甲醇等溶劑提取率。結(jié)果表明，30%甲醇的提取率不僅高于水和10%甲醇而且與50%甲醇比較在300～400nm區(qū)域內(nèi)吸收帶強(qiáng)度弱。

3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小白蒿炭的作用機(jī)理及其止血成分較為復(fù)雜。小白蒿炭的止血作用并不與鞣質(zhì)和總黃酮含量呈平行關(guān)系，而可能與炒炭過(guò)程中原有成分的比例改變，或者產(chǎn)生了新的成分，如止血與抗止血成分比例的變化及炭素的產(chǎn)生等有關(guān)。

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