莊禧懿，儲(chǔ)衛(wèi)華,，馬興旺，朱 衛(wèi)

(1.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210009；2.南京日升康生物工程有限公司，江蘇 南京 211103)

紅曲霉菌屬真菌界(Eumycophyta)、子囊菌門(Ascomycota)、真子囊菌綱(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、紅曲菌科(Monascaceae)、紅曲菌屬(Monascus)[1]。由紅曲菌接種于大米發(fā)酵得到的紅曲具有防腐、解毒、消食活血、健脾燥胃之功效[2]，同時(shí)，紅曲菌具有很強(qiáng)的產(chǎn)色素能力，紅曲色素作為天然色素應(yīng)用于食品著色歷史悠久。紅曲色素分為黃色素、橙色素和紫紅色素[3，4]。急性毒性試驗(yàn)、亞急性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)和致突變?cè)囼?yàn)表明，紅曲色素?zé)o毒副作用和致突變作用。隨著人們對(duì)合成食品添加劑和化學(xué)藥物對(duì)人體毒副作用的認(rèn)識(shí)，世界各國(guó)掀起了食用綠色食品和使用天然藥物的熱潮，紅曲作為藥食兼用的天然制品，引起了極大的關(guān)注。與化工合成的色素相比，紅曲色素具有安全性高、穩(wěn)定性好、色調(diào)柔和、pH值穩(wěn)定、對(duì)蛋白質(zhì)的著色力強(qiáng)且兼具抗菌性等特點(diǎn)，是一種具有悠久應(yīng)用歷史的天然色素[5,6]。

作者從市售不同紅曲發(fā)酵產(chǎn)品中分離得到紅曲霉純培養(yǎng)菌株，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行屬和種的鑒定，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素工藝進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步發(fā)掘紅曲菌生物資源做了有益探索。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑和儀器

市售功能性紅曲米粉，紅曲發(fā)酵飼料，紅腐乳等。

乳酸，無水乙醇。

高壓滅菌鍋，電熱恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，顯微鏡，UV-2100 型分光光度計(jì)等。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：(1)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)；(2)孟加拉紅培養(yǎng)基；(3)麥芽汁液體培養(yǎng)基加乳酸調(diào)pH值2.5，加10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇。

形態(tài)鑒定平板培養(yǎng)基：(1)麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(Wa培養(yǎng)基)；(2)察氏瓊脂培養(yǎng)基；(3)PDA培養(yǎng)基。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖90，蛋白胨30，KH2PO41.0，MgSO41.0，MnSO40.1，ZnSO40.1，pH值6.0。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉菌株的分離

稱取10.0 g 紅曲粉，加入到90 mL帶玻璃球的無菌生理鹽水中，振搖10 min，10倍梯度稀釋。吸取0.1 mL稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～7 d，挑取單菌落轉(zhuǎn)移接種到新的分離培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)反復(fù)分離純化得到較純的菌株，保藏。

1.3.2 菌株形態(tài)學(xué)觀察

將篩選的菌株的孢子劃線接種到形態(tài)鑒定培養(yǎng)基平板上，放入培養(yǎng)箱中，30 ℃倒置培養(yǎng)，每天觀察記錄各菌株的菌落形態(tài)。菌絲和孢子顯微結(jié)構(gòu)的觀察采用插片培養(yǎng)法[7]，將接種好的培養(yǎng)皿置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期取出蓋玻片觀察其菌絲結(jié)構(gòu)、繁殖結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征。

1.3.3 液體發(fā)酵及色價(jià)測(cè)定

制作液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝到三角瓶中，裝液量為50 mL/250 mL，滅菌待用。無菌條件下將分離純化的菌株制成孢子懸液，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)，考察接種量、培養(yǎng)基初始pH值等條件對(duì)產(chǎn)紅曲色素的影響。

紅曲色素的提取及其色價(jià)測(cè)定[8]：取發(fā)酵液5 mL，加入75%乙醇45 mL，靜置浸提4 h，過濾。濾液再以75%乙醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，以75%乙醇作空白對(duì)照，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定OD值。將OD值乘以稀釋倍數(shù)，即為紅曲色素色價(jià)(單位為 U·mL-1)。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)紅色素菌株的分離純化及形態(tài)

將不同的紅曲產(chǎn)品接種到分離培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，獲得了15株菌株， 其中一株肉眼可見產(chǎn)紅色素高于其它菌株，命名為RP-1。將RP-1孢子稀釋液涂布PDA培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)，3～4 d 后可見白色團(tuán)狀菌絲，7 d 后菌絲轉(zhuǎn)為紅色，紅色素?cái)U(kuò)散至整個(gè)培養(yǎng)基中(圖1)。

圖1 產(chǎn)紅色素霉菌在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征

2.2 RP-1形態(tài)學(xué)鑒定

在普通光學(xué)顯微鏡下觀察(圖2)，RP-1的菌絲呈不規(guī)則型分枝，多核，有橫隔，含油滴，無色透明或含深淺不一的紅色素，分生孢子呈球形，著生于菌絲及其分枝的頂端，孢子單生或鏈狀，閉囊殼球形，有柄。根據(jù)菌落及顯微形態(tài)，初步鑒定RP-1為紅色紅曲菌(Monascusruber)。

圖2 RP-1顯微形態(tài)特征(10×40)

2.3 培養(yǎng)條件對(duì)RP-1產(chǎn)紅曲色素的影響

2.3.1 接種量

接種量會(huì)對(duì)微生物生物量及代謝產(chǎn)物產(chǎn)生較大的影響。分別選用4種不同的接種量(1%、5%、10%和15%)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過7 d的培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著接種量的增加，紅曲色素色價(jià)提高，當(dāng)接種量為15%時(shí)，其色價(jià)達(dá)到126.0 U·mL-1。

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH值

pH值是微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成過程中重要的生理參數(shù)之一，對(duì)微生物酶活有顯著的影響，同時(shí)還會(huì)引起細(xì)胞膜透性以及菌體形態(tài)的變化，從而影響菌體對(duì)養(yǎng)分的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。培養(yǎng)基初始pH值分別設(shè)定為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為4.0時(shí)，紅曲色素色價(jià)為47.8 U·mL-1；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為5.0時(shí)，紅曲色素色價(jià)有所上升，但不明顯；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為6.0時(shí)，其色價(jià)最高，達(dá)132.0 U·mL-1；而當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為7.0時(shí)，其色價(jià)有所下降；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為8.0時(shí)，其色價(jià)為115.6 U·mL-1。這可能跟真菌的適宜生長(zhǎng)pH值有關(guān)。因此，紅曲霉RP-1液體發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的培養(yǎng)基最佳初始pH值為6.0。

2.3.3 討論

后家衡等[9]研究表明，接種量為5.0%、培養(yǎng)溫度為30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為72 h、培養(yǎng)基初始pH值為6.0時(shí)，3 株紅曲霉中以Mg 菌株產(chǎn)色素最高，并在以番薯粉為碳源的培養(yǎng)基中色素產(chǎn)量最高；而劉德華等[10]研究表明，5%～20%的接種量、培養(yǎng)基初始pH值7.0最有利于紅曲色素的合成。他們的研究結(jié)果與本研究有所差別，表明紅曲霉不同菌株產(chǎn)色素能力有著很大差異，優(yōu)化發(fā)酵條件可以顯著提高色素色價(jià)，因此進(jìn)行色素高產(chǎn)菌株篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化是十分有必要的。

3 結(jié)論

從市售紅曲發(fā)酵產(chǎn)品中成功分離得到15株紅曲霉純培養(yǎng)菌株，其中一株肉眼觀察高產(chǎn)紅色素，通過形態(tài)特征觀察，初步鑒定該菌株為紅曲屬(Monascus)中的紅色紅曲菌(Monascusruber),命名為RP-1。下一步有必要對(duì)分離到的RP-1進(jìn)行18S rDNA、GC含量測(cè)定以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

對(duì)紅曲霉RP-1的液體搖瓶發(fā)酵工藝進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種量以及培養(yǎng)基初始pH值等發(fā)酵參數(shù)對(duì)紅曲霉RP-1液體發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素色價(jià)有影響，接種量為15%、培養(yǎng)基初始pH值為6.0時(shí)，最有利于紅曲色素的合成。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李鐘慶，郭芳.紅曲菌的形態(tài)與分類學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2003：2～6，11，45-48.

[2] 邢旺興，程榮珍，宓鶴鳴，等.幾種常見紅曲霉的生理學(xué)特性研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2001，19(4)：231-234.

[3] Wong H C，Koehler P E.Mutant forMonascus-pigment production[J].Food Science,1981，46(3)：956-957.

[4] Bai M D，Cheng C H，Wan H M，et al.Microalgal pigments potential as byproducts in lipid production[J].Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers，2011，42(5)：783-786.

[5] Carvalho J C，Oishi B O，Pandey A，et al.Biopigments fromMo-nascus：Strain selection，citrinin production and color stability[J].Brazilian Archives of Biology and Technology,2005，48(6)：885-894.

[6] Mapari S A S，Nielsen K F，Larsen T O，et al.Exploring fungal biodiversity for the production of water-soluble pigments as potential natural food colorants[J].Current Opinion in Biotechnology，2005，16(2):231-238.

[7] 周長(zhǎng)林.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)與指導(dǎo)(第二版)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[8] 彭中健，梁淑娃，陳鄖東，等.紅曲霉深層發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的研究[J].四川食品與發(fā)酵，2004，40(3)：28-31.

[9] 后家衡，葉硯，徐曉波,等.紅曲霉產(chǎn)色素發(fā)酵條件優(yōu)化及抑菌性能的測(cè)定[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版),2009,27(4):363-367.

[10] 劉德華，劉代喜，丁海洋,等.紅曲霉JR液體發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的工藝研究[J].中國(guó)釀造，2010，(5)：59-61.