姚志文 劉 唯 程由勇 李紅玖 李春華 于大海

1.廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518104；2.廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021021

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能促進(jìn)舌癌（carcinoma of tongue）中血管的生成，與舌癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-2]，抑制VEGF基因的表達(dá)可望抑制舌癌血管的生成，從而抑制舌癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究以VEGF基因?yàn)榘悬c(diǎn)，構(gòu)建VEGF-siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染舌癌Tca8113細(xì)胞，研究其對(duì)Tca8113細(xì)胞VEGF基因表達(dá)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

Tca8113細(xì)胞株（四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），Psilencer 2.1-U6-neo真核表達(dá)載體（美國(guó) Ambion公司），脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000（美國(guó) Invitrogen 公司），質(zhì)粒小劑量提取試劑盒（美國(guó)Omega公司），大腸桿菌DH5α（武漢晶賽生物公司），G418試劑（美國(guó)Gbico公司），人VEGFELISA試劑盒 （上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司），限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶 （美國(guó)NEB公司），HRP標(biāo)記兔抗人的IgG抗體（美國(guó)Gbico公司），鼠抗人VEGF的單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因特異的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)已知VEGF mRNA序列，參考siRNA的設(shè)計(jì)有關(guān)文獻(xiàn)[3]，設(shè)計(jì)針對(duì)VEGF基因不同剪切子的公共靶點(diǎn)，根據(jù)所選靶點(diǎn)人工合成VEGF基因RNAi靶序列（5′-GATAGAGCAAGACAAGAAA-3′）及其互補(bǔ)的反義鏈。以及一條實(shí)驗(yàn)對(duì)照序列（即無(wú)關(guān)序列HK：5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3'）及其互補(bǔ)的反義鏈。靶序列和實(shí)驗(yàn)對(duì)照序列各自的互補(bǔ)兩條寡核苷酸片段經(jīng)退火連接形成雙鏈DNA模板鏈。用Bam HI+HindⅢ對(duì)質(zhì)粒Psilencer 2.1-U6-neo進(jìn)行雙酶切。T4 DNA連接酶將線(xiàn)性化Psilencer 2.1-U6-neo和模板鏈連接成重組載體，靶序列與實(shí)驗(yàn)對(duì)照序列重組載體分別命名為Pu-VEGF-siRNA載體和Pu-HK載體。

1.2.2 重組載體的酶切和測(cè)序 重組的Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK載體轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5α 細(xì)菌，50μg/mL的 Ampr抗性LB培養(yǎng)皿篩選陽(yáng)性克隆，質(zhì)粒提取試劑盒按說(shuō)明提取重組載體。SalⅠ酶切重組載體，測(cè)序鑒定。

1.2.3 重組載體的轉(zhuǎn)染 10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以每孔1×106/mL細(xì)胞接種24孔培養(yǎng)板并培養(yǎng)過(guò)夜。按說(shuō)明書(shū)使用Lipofectamine 2000將含有重組Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK載體分別轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為三組，轉(zhuǎn)染Pu-VEGF-siRNA為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染Pu–HK載體組作實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，未轉(zhuǎn)染組作空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組G418篩選1周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色分析Tca8113細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá) 常規(guī)SABC法檢測(cè)Tca8113細(xì)胞VEGF的蛋白表達(dá)，各組隨機(jī)選取100個(gè)Tca8113染色細(xì)胞，使用MIAS－2000醫(yī)用彩色病理圖像免疫組化測(cè)量系統(tǒng)對(duì)其灰度值進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）測(cè)定Tca8113細(xì)胞上清液的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá) 按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，收集各組Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用OD值作縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制。根據(jù)Tca8113細(xì)胞上清OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中可以查出對(duì)應(yīng)濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組載體酶切鑒定

質(zhì)粒Psilence 2.1-U6-neo基因序列里沒(méi)有SalⅠ酶切位點(diǎn)，本研究插入的序列里設(shè)計(jì)有SalⅠ酶切位點(diǎn)，Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK質(zhì)粒均能被SalⅠ酶切，即均為插入正確的質(zhì)粒（圖 1）。

2.2 重組載體基因測(cè)序

經(jīng)酶切鑒定的重組質(zhì)粒送往上海生工公司進(jìn)行DNA全長(zhǎng)測(cè)序。所得結(jié)果如圖2～3。經(jīng)Blaster對(duì)比，測(cè)序結(jié)果與GenBank的VEGF基因序列完全一致，證實(shí)重組載體構(gòu)建成功。

2.3 免疫組織化學(xué)染色SABC法分析Tca8113細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)

圖1 重組載體的酶切鑒定

圖2 Pu-VEGF-siRNA DNA測(cè)序

圖3 Pu-HK DNA測(cè)序

圖4 空白對(duì)照組Tca8113細(xì)胞胞漿染色明顯（×400）

結(jié)果如圖4～6所示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，細(xì)胞著色顆粒明顯減少，而且著色變淺。對(duì)照組灰度值比實(shí)驗(yàn)組的明顯降低（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定Tca8113細(xì)胞上清液血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，VEGF蛋白濃度有所降低（P＜0.05）。以實(shí)驗(yàn)對(duì)照組VEGF相對(duì)水平作參照，實(shí)驗(yàn)組濃度下降34.64%。與空白對(duì)照組比較，蛋白質(zhì)量濃度相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖7。

3 討論

圖5 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組Tca8113細(xì)胞胞漿染色明顯（×400）

圖6 實(shí)驗(yàn)組TCA8113細(xì)胞胞漿染色減少（×400）

RNAi（RNA interference）是指由小分子雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過(guò)阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，相應(yīng)mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，它具有高穩(wěn)定性、靶向性和高效率性等特點(diǎn)[4]，目前已經(jīng)成為篩選新基因、基因功能研究、基因疾病治療和尋找藥物靶點(diǎn)的重要工具[5-7]。

本實(shí)驗(yàn)以人VEGF基因作為RNAi的靶基因，目的通過(guò)VEGF siRNA靶向阻斷或抑制VEGF的表達(dá)，達(dá)到阻斷或抑制VEGF促舌癌血管形成，進(jìn)而抑制舌癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的目的。VEGF mRNA的剪切方式的不同可產(chǎn)生5種不同形式蛋白分子：VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145、VEGF121。不同的VEGF分子協(xié)同作用促進(jìn)腫瘤血管形成[8]。本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)已知VEGF mRNA序列，參考siRNA的設(shè)計(jì)有關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)針對(duì)VEGF mRNA公共序列的靶點(diǎn)，體外構(gòu)建Pu-VEGF-siRNA重組載體，然后利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞并使其在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。常規(guī)SABC法和ELISA檢測(cè)Tca8113細(xì)胞VEGF的蛋白表達(dá)結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染Pu-VEGF-siRNA重組載體后，實(shí)驗(yàn)組Tca8113細(xì)胞的VEGF蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組有所減弱，而且空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的VEGF蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異；說(shuō)明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體Pu-VEGF-siRNA對(duì)人舌癌細(xì)胞株Tca8113中VEGF有較強(qiáng)的特異性抑制效果。這與其他學(xué)者[8]構(gòu)建針對(duì)VEGFmRNA公共序列靶點(diǎn)，體外構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)染相應(yīng)癌細(xì)胞后有效抑制VEGF表達(dá)結(jié)果一致。

圖7 三組細(xì)胞上清液血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白濃度

筆者通過(guò)構(gòu)建Pu-VEGF-siRNA重組載體并體外轉(zhuǎn)染舌癌Tca8113細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明能夠特異和有效地抑制癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)。這為應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對(duì)舌癌進(jìn)行基因治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，為舌癌的治療選擇開(kāi)辟了新的途徑。

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