石繼連 劉文龍 楊巖濤 鄧凱文 陳 鋒 唐 昱 賀福元

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥藥性與藥效國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙 410007

正交設(shè)計(jì)優(yōu)選碎米糖化液的脫色工藝

石繼連1劉文龍1楊巖濤1鄧凱文2陳 鋒1唐 昱1賀福元1

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥藥性與藥效國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙 410007

目的 優(yōu)選碎米糖化液脫色的最佳工藝條件。方法 以活性炭為脫色劑，在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)碎米糖化液進(jìn)行活性炭用量、加熱溫度和脫色時(shí)間等因素的考察，以葡萄糖保留率和脫色率為指標(biāo)，選擇最佳工藝。結(jié)果 碎米糖化液活性炭脫色的最佳工藝為：糖化液加入3%的活性炭后，在70℃下脫色40 min。 結(jié)論 本文所建立的脫色工藝簡(jiǎn)單可行，可為進(jìn)一步制備注射用葡萄糖的脫色工藝研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

碎米；糖化液；葡萄糖；脫色；工藝；正交設(shè)計(jì)

注射用葡萄糖原料多以玉米為原料加工制備而成，用碎米制備注射用葡萄糖可以提高其深加工附加值。碎米制備注射用葡萄糖的過程中，其糖化液含有色素等雜質(zhì)需要除去。目前，對(duì)碎米制備注射用葡萄糖的研究尚未見報(bào)道，更未見碎米糖化液的活性炭脫色工藝的研究報(bào)道。本文采用活性炭對(duì)糖化液進(jìn)行脫色，在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察活性炭用量、加熱溫度及時(shí)間等因素，以期探索糖化液脫色的最適宜條件，為進(jìn)一步制備注射用葡萄糖的脫色工藝研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 材料

糖化液（自制），活性炭（臺(tái)山市化工廠有限公司，批號(hào)：20090401，分析純），D-無水葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：1108334-200503）。乙腈為色譜純，流動(dòng)相用水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters1525高效液相色譜儀（Waters 2410示差折光檢測(cè)

器及Breeze色譜工作站），TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），AR1140/C分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 葡萄糖含量及葡萄糖保留率的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取D-無水葡萄糖對(duì)照品適量，置50 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，搖勻制成濃度為75 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 將糖化液置具塞錐形瓶中，在60℃下水浴30 min（不斷振搖），取出，冷卻至室溫，以濾紙抽濾，濾液以0.45 μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液。

2.1.3 陰性溶液的制備 將超純水以0.45 μm微孔濾膜過濾，得陰性溶液。

2.1.4 色譜條件 色譜柱為UltimateXB-WH2柱（250mm×4.5mm，2.5 μm）；流動(dòng)相為乙腈∶水（65∶35）；流速為 1 mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為209 nm；進(jìn)樣量為10 μL，理論塔板數(shù)按葡萄糖計(jì)不低于4 500。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取1 mL葡萄糖對(duì)照品溶液置 2、5、10、25、50 mL 容量瓶中， 加超純水稀釋至刻度，制成濃度為 37.5、15.0、7.5、3.0、1.5 mg/mL 的溶液，分別吸取 10 μL注入高效色譜儀中，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y=71 346X+43 892，r=0.999 7，表明葡萄糖濃度在 1.5～37.5 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖1。

圖1 陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液HPLC色譜圖

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，分別測(cè)定其峰面積，計(jì)算RSD為1.16%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液， 分別于0、2、4、8、12、24 h后測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD為2.72%，結(jié)果表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批糖化液6份，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下的方法測(cè)定其峰面積，計(jì)算RSD為2.07%，表明溶液有較好的重復(fù)性。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的糖化液9份，分別精密加入80%、100%和120%的葡萄糖對(duì)照品各3份，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下的方法測(cè)定其峰面積，計(jì)算葡萄糖的平均加樣回收率為98.76%，RSD為2.07%。

2.1.10 葡萄糖保留率的測(cè)定 取脫色后的糖化液測(cè)定其葡萄糖含量，與未經(jīng)活性炭脫色品比較，計(jì)算其葡萄糖保留率。保留率（%）=（脫色后葡萄糖含量/脫色前葡萄糖含量）×100%。

2.2 色素吸光度的測(cè)定[1]

將濾紙過濾后的糖化液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，糖化液在254 nm處有最大吸收，故選擇此波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定糖化液的吸光度，用蒸餾水作空白液，在254 nm處測(cè)定脫色后的吸光度。脫色率（%）=[（脫色前色素吸光度-脫色后色素吸光度）/脫色前色素吸光度]×100%。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，選取活性炭用量、加熱溫度及脫色時(shí)間等主要因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)選其脫色工藝條件，因素水平的設(shè)計(jì)見表1。精密量取糖化液100 mL共9份，分別置于250 mL錐形瓶中，加入一定量的活性炭（按糖化液的固形物含量比例計(jì)），在一定的溫度下水浴脫色一定的時(shí)間，不斷振搖，過濾后，分別照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下的方法測(cè)定葡萄糖保留率及脫色率。結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由方差分析結(jié)果可知，因素A對(duì)綜合指標(biāo)的影響有顯著性（P＜0.05），結(jié)合其極差分析，選取 A2水平；B、C對(duì)指標(biāo)影響均無顯著性，但結(jié)合單因素考察結(jié)果、極差分析結(jié)果及生產(chǎn)實(shí)際情況，B和C因素均選取水平2。綜合分析，確定出糖化液的脫色較優(yōu)工藝條件是A2B2C2，即糖化液加入3%的活性炭后，在70℃下脫色40 min。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述較優(yōu)工藝條件制備3批樣品，進(jìn)行工藝驗(yàn)證，結(jié)果葡萄糖的平均保留率為94.76%，RSD為1.83%；平均脫色率為96.39%，RSD為2.16%?？梢姲磧?yōu)化工藝進(jìn)行脫色，葡萄糖的保留率及脫色率均取得較理想的結(jié)果，表明該工藝合理、穩(wěn)定、可行。

3 討論

在醫(yī)藥生產(chǎn)中常見的脫色劑有活性炭、雙氧水、DEAE纖維素、大孔樹脂及離子交換樹脂等，其中活性炭的脫色能力和生產(chǎn)成本等性價(jià)比，在糖化液的脫色生產(chǎn)中是相對(duì)最高的，且不會(huì)影響產(chǎn)品的化學(xué)性質(zhì)，故本研究采用活性炭作為糖化液的脫色劑。目前測(cè)定葡萄糖含量的方法有化學(xué)法、氣相色譜法、離子色譜脈沖安培法、毛細(xì)管電泳電化法、液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法等。但這些方法具有操作繁瑣、測(cè)量結(jié)果難判定、檢測(cè)儀器價(jià)格昂貴、專用性強(qiáng)、普及程度不高等缺點(diǎn)[2]。高效液相色譜法雖已有報(bào)道[2-5]，但經(jīng)多次預(yù)試發(fā)現(xiàn)這些條件均對(duì)本研究中糖化液樣品的分離效果較差而改用本文所述方法。

筆者在前期進(jìn)行過單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察了活性炭用量、糖化液的pH值、加熱溫度及加熱時(shí)間等4個(gè)主要影響因素，發(fā)現(xiàn)其中活性炭的用量對(duì)葡萄糖的保留率及脫色率影響最顯著，其余因素影響相對(duì)較小?？紤]到為了制備純度高的注射用葡萄糖原料，在脫色過程中不宜再加入酸、堿等新雜質(zhì)調(diào)整糖化液的pH值，故本實(shí)驗(yàn)不再考慮本來影響脫色效果較小的因素pH值，進(jìn)一步考察研究其余3個(gè)因素對(duì)糖化液脫色效果的影響大小，對(duì)其脫色工藝條件初步優(yōu)化。為此，本研究已申請(qǐng)專利（申請(qǐng)?zhí)枮?01010547831.2）。

若制備注射用葡萄糖，還需深入細(xì)致研究，結(jié)合吸附蛋白質(zhì)的情況，采用精度和預(yù)測(cè)性更好的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法[6]優(yōu)化，可取得最佳脫色工藝條件。結(jié)合后續(xù)的去離子工序后進(jìn)行的第2次脫色研究，可進(jìn)一步純化葡萄糖，并可將第2次脫色所用的活性炭充分利用到第1次脫色過程中，也可大大節(jié)約生產(chǎn)成本。

[1]周鴻立，吳德恒，董衛(wèi)權(quán)，等.玉米須多糖脫色工藝條件的研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2010，44（4）：76.

[2]林長(zhǎng)欽，李穎怡，劉垚.高效液相色譜示差法測(cè)定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，37（4）：254-256.

[3]張書芬，史萍萍，王全林，等.液相色譜示差折光法測(cè)定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖[J].食品科學(xué)，2008，29（6）：280-283.

[4]宋更申，姜建國(guó)，孫婷.HPLC法測(cè)定葡萄糖氯化鈉注射液中葡萄糖的含量[J].中國(guó)藥房，2010，21（1）：74.

[5]王浩，劉艷琴，楊紅梅，等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定無糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖[J].分析化學(xué)，2010，38（6）：873-876.

[6]陸剛，杜國(guó)棟，王俊儒，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化丹參須根有效成分的酶法提取工藝[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33（16）：1976.

Optimization of decoloration technology of saccharification liquid from broken rice by orthogonal design

SHI Jilian1LIU Wenlong1YANG Yantao1DENG Kaiwen2CHEN Feng1TANG Yu1HE Fuyuan1
1.School of Pharmacy,Hu′nan University of Chinese Medicine,the Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine in Medicinal Properties and Efficacy of the State Administration of Traditiomal Chinese Medicine,Hu′nan Province,Changsha 410208,China;2.The First Affiliated Hospital of Hu′nan University of Chinese Medicine,Hu′nan Province,Changsha 410007,China

ObjectiveTo optimize the decoloring technology conditions of saccharification liquid from broken rice.MethodsTaking the active carbon as decoloring agents,the orthogonal experiments was performed on the single factor basis,with the purpose of investigation in the active carbon dosage,heating temperature and decoloring time of saccharification liquid from broken rice,glucose reserve rate and the decoloring rate were taken as the indexes to optimize the discolored technology.ResultsThe optimum decoloring conditions of saccharification liquid from broken rice was 3%active carbon,with decoloring of 40 min under 70℃.ConclusionThe decoloring technology is simple,practicable and available.It can provide experimental basis for the further decoloring technology research on the glucose injection.

Broken rice;Saccharification liquid;Glucose;Decoloration;Technology;Orthogonal design

TQ461

A

1673-7210（2012）01（c）-0117-03

湖南省科技廳科研課題（項(xiàng)目編號(hào)：2010SK3019）。

石繼連（1973-），男，漢族，湖南會(huì)同人，副教授，碩士生導(dǎo)師，執(zhí)業(yè)藥師；研究方向：中藥炮制與制劑。

賀福元（1965-），男，漢族，湖南祁東人，博士后，教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：遺傳中藥藥理學(xué)、譜動(dòng)學(xué)、譜效學(xué)、譜效動(dòng)力學(xué)、譜量學(xué)、中藥藥劑學(xué)及中醫(yī)藥信息數(shù)學(xué)。

2011-09-14 本文編輯：衛(wèi) 軻）