廖家有 夏 勇

1.徐州醫(yī)學院心血管病研究所，江蘇 徐州 221006；2.徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內科，江蘇 徐州 221006

早期心肌肥大是為滿足心臟做功需要而發(fā)生的代償性變化，但長期持續(xù)的心肌肥大則可導致心功能失代償而發(fā)生心衰。抑制或延緩心肌肥厚的發(fā)生是當前研究熱點之一。鈣調神經磷酸酶（calcineurin,CaN）是一種受Ca2+/鈣調蛋白調節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶。研究發(fā)現(xiàn)，內皮素、血管緊張素等多種心肌肥大刺激因子都是通過CaN來發(fā)揮作用的[1]。近來的研究提示大蒜素可通過多種機制延緩高血壓引起的心肌肥厚及纖維化[2-3]。本實驗通過制作壓力負荷大鼠心肌肥厚模型，觀察大蒜素對心肌肥厚及CaN信號通路的影響，為大蒜素預防心血管疾病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD雌性大鼠50只，體重（200±30）g，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 大蒜素由徐州萊恩藥業(yè)股份有限公司提供，規(guī)格30 mg/支，生產批號0901241。纈沙坦膠囊由北京諾華制藥有限公司生產，規(guī)格80 mg/粒，生產批號X0802。RIPA組織裂解液購于碧云天生物技術研究所。CaN-A一抗，GAPDH、C-fos一抗及堿性磷酸酶標記的二抗均購于中杉金橋公司。內皮素（ET1）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）酶聯(lián)免疫試劑盒購于上海亞培生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型與分組 取30只大鼠行腹主動脈縮窄術作為手術組。根據Rodriguez-Iturbe等[4]的方法，在雙腎動脈上方分離一小段腹主動脈，用銀夾造成腹主動脈部分縮窄（銀夾內徑0.7 mm）。術后3 d將大鼠隨機分為模型組、大蒜素組和纈沙坦組，每組10只。再取10只大鼠作為假手術組，只分離腹主動脈，不用銀夾縮窄。術后3 d開始給藥，大蒜素組給大蒜素10 mg/（kg·d）腹腔注射；纈沙坦組給予纈沙坦 20 mg/（kg·d），以1 mL生理鹽水混勻后灌胃；假手術組、模型組以1 mL生理鹽水灌胃，給藥6周。

1.2.2 血流動力學檢測及血漿提取 術后6周，大鼠稱重，麻醉，分離右側頸總動脈逆行插管至左心室，記錄左室收縮峰壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）。經頸動脈導管取血 5 mL注入含 10%EDTA-2Na 30 μL 和抑肽酶 40 μL 試管中，4℃3 000 r/min離心10 min，分離血漿，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 左室肥厚指數及組織蛋白的提取 采血后處死動物，取出心臟，剪去出入心臟的大血管，稱重即為心臟總重（HW），然后剪去左右心房及右室游離壁，保留左室心肌組織（包括左室游離壁及室間隔），再次稱重即為左室重量（LVW）。計算左室肥厚指數（LVMI）=LVW（g）×1000/BW（g）。 取 200 mg 心肌組織加入2 mL RIPA組織裂解液進行勻漿，將勻漿液4℃12 000 r/min離心10 min，取上清定蛋白濃度后，煮沸變性，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 心肌的組織形態(tài)學觀察 HE染色，石蠟切片厚度為5μm，光鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法

用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，所有數據以均數±標準差（）表示，進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血流動力學參數及血漿AngⅡ、ET1水平的比較

與假手術組相比，各手術組LVSP及LVEDP增加，大蒜素組及纈沙組LVSP較模型組低（P＜0.05），兩給藥組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），各手術組LVEDP比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各手術組血漿AngⅡ、ET1水平明顯高于假手術組，纈沙坦組AngⅡ增高最為明顯（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血流動力學參數及血漿血管緊張素Ⅱ、內皮素水平比較（）

表1 各組大鼠血流動力學參數及血漿血管緊張素Ⅱ、內皮素水平比較（）

注：與假手術組比較，＃P ＜ 0.05；與模型組比較，*P ＜ 0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

組別 只數 LVSP（mm Hg）LVEDP（mm Hg）AngⅡ（ng/L）ET-1（ng/L）假手術組模型組大蒜素組纈沙坦組10 10 10 10 115.49±13.23 168.90±10.71#149.45±11.19#*138.30±14.48#*4.16±1.21 10.84±1.36#6.91±1.20#6.70±1.42#323.82±83.61 876.97±116.54#579.53±108.72#1 348.12±130.25#140.46±36.65 429.31±88.09#306.59±49.14#395.86±42.05#

2.2 心肌的組織形態(tài)學比較

假手術組細胞大小、形態(tài)較一致，結構清晰，間隙邊緣清楚，肌纖維排列整齊。纈沙坦組心肌肥大較輕，心肌組織紋理結構尚整齊。大蒜素組心肌細胞增生肥大較假手術組明顯，局部結構不清晰，細胞間隙變窄較纈沙坦組明顯，細胞核數目則相對較少，紋理輕度紊亂。模型組心肌肥大最為明顯，細胞邊緣不清晰，呈融合狀，胞核數目較多。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織結構的對比（HE染色，×400）

2.3 左室肥厚指數、左室重量、心臟總重及體重的比較

各手術組LVW及LVMI明顯增高，大蒜素組、纈沙坦組LVMI明顯低于模型組。見表2。

2.4 CaN-A、C-fos蛋白水平表達

Western Blot檢測心肌細胞CaN-A、C-fos蛋白水平的表達，用GAPDH為內參進行光密度校正（圖2），結果示各手術組CaN-A、C-fos蛋白表達均高于假手術組（P＜0.05），兩給藥組低于模型組（P＜0.05），給藥組之間無差異（P＞0.05）。

圖2 鈣調神經磷酸酶（CaN-A）、C-fos蛋白水平表達

3 討論

在腎動脈上方使腹主動脈部分狹窄可以造成心臟后負荷的增加，心臟發(fā)生代償性心肌肥厚，同時因為腎血流量的減少，可導致體內RAS系統(tǒng)的激活及多種肥大刺激因子含量升高，這些體液因子的增高一方面有利于維持心功能，另一方面成為細胞肥大的刺激因素。而CaN信號轉導系統(tǒng)在上述肥大刺激因子信號傳遞網絡中處于非常關鍵的位置。CaN激活后能活化多種心肌肥厚相關基因，并誘導細胞增殖相的原癌基因，如C-fos、C-jun等的表達，使心肌向胚胎化方向發(fā)展，細胞內蛋白合成增加，細胞外間質增多，細胞體積增大，最終導致心肌肥厚。因此，CaN在壓力超負荷性心肌肥大中發(fā)揮著關鍵作用，是超負荷性心肌肥大的重要上游調節(jié)機制[5]，并且阻斷CaN信號通路已經成為預防和治療心肌肥厚及心衰的新靶點[6]。

本實驗中各手術組血漿AngⅡ，ET1水平及心肌細胞中CaN-A、C-fos蛋白的表達均明顯增高，其中纈沙坦組AngⅡ水平增高最為明顯，這可能與纈沙坦在受體水平上阻滯AngⅡ的作用后反饋性引起RAS活性增加有關。本實驗還從LVMI、左室心肌病理學形態(tài)等方面觀察大蒜素對壓力負荷大鼠心肌組織重塑的影響。病理結果顯示，壓力負荷增加引起的心肌肥厚屬于向心性肥厚，室壁增厚且室腔容積減少明顯，心肌細胞肥大，組織結構變紊亂。其中各手術組LVMI均高于假手術組，給藥組同模型組比較，心肌肥厚有不同程度的減輕，纈沙坦組明顯低于模型組，大蒜素組較模型組有降低趨勢，但與纈沙坦組及模型組比較無差異（P＞0.05）。這說明大蒜素雖然對延緩心肌肥厚有一定的作用，但是作用效果不如纈沙坦明顯。

表2 各組大鼠體重、左室重量（LVW）、心臟總重（HW）及左室肥厚指數（LVMI）的比較（）

表2 各組大鼠體重、左室重量（LVW）、心臟總重（HW）及左室肥厚指數（LVMI）的比較（）

注：與假手術組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 只數LVW（g） HW（g） LVMI體重（g）術時 術后6周假手術組模型組大蒜素組纈沙坦組10 10 10 10 202.56±13.34 203.50±10.01 209.47±11.78 207.22±13.23 332.45±22.38 317.00±13.08 325.10±21.40 304.44±20.68 0.53±0.07 0.87±0.15#0.72±0.06#0.69±0.10#0.80±0.11 1.16±0.19#1.02±0.08#0.99±0.13#1.62±0.21 2.71±0.16#2.31±0.14#*2.26±0.17#*

近年來的大量研究及薈萃分析表明，大蒜素具有降壓、抗氧化、降脂、抗腫瘤等廣泛的生物學活性，其在心腦血管疾病中的預防保健作用已得到國內外學者的廣泛認同。目前對于大蒜素降壓的具體機制仍不清楚。大多數學者認為，大蒜素降壓的機制可能是抑制內皮素的合成和釋放，使周圍血中保持較低的內皮素水平，同時增強內皮細胞一氧化氮合酶活性，提高一氧化氮水平，從而防止血管痙攣，降低血管張力[7]。Sharifi等[8]則認為大蒜素的降壓作用與拮抗血管緊張素轉化酶有關。本實驗表明大蒜素對延緩壓力后負荷增加所致的心肌肥厚有一定的作用，其可能原因是通過降低血液循環(huán)中AngⅡ、ET1水平，降低血壓，并同時減少對CaN信號通路的激活有關。

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