洪興福，李寶賽，孫震曉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物制藥系，北京 100102)

微管存在于幾乎所有真核細(xì)胞中，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分之一，由微管蛋白和微管相關(guān)蛋白構(gòu)成，可以通過(guò)其亞單位的組裝和去組裝改變其長(zhǎng)度或存在狀態(tài)。微管在維持細(xì)胞形態(tài)、參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、錨定細(xì)胞器位置和運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)中起著非常重要的作用。特別是在細(xì)胞有絲分裂的過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞由分裂間期進(jìn)入分裂期后，細(xì)胞質(zhì)中的微管解聚成微管蛋白，參與紡錘體的裝配，介導(dǎo)染色體的運(yùn)動(dòng);分裂進(jìn)入末期后，紡錘體解聚形成游離的微管蛋白，重新參與細(xì)胞間期微管的組裝。干擾微管蛋白聚合-解聚過(guò)程的藥物，往往會(huì)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡，因此，以微管為靶點(diǎn)的藥物，一直都是研究抗癌藥物的熱點(diǎn)。

為了更好地研究微管蛋白聚合-解聚的條件以及藥物對(duì)微管蛋白聚合-解聚的影響，科學(xué)家利用微管蛋白具有在37℃條件下聚合，而在0℃條件下解聚的特點(diǎn)，從動(dòng)物的腦組織勻漿中提取微管蛋白，向微管蛋白中加入Mg2+，GTP(或ATP)和EDTA，實(shí)現(xiàn)了微管蛋白在離體條件下的組裝與去組裝，該實(shí)驗(yàn)體系已成為篩選和研究以微管為靶點(diǎn)的抗癌藥物的重要手段［1-3］。

去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)系斑蝥素(cantharidin)的結(jié)構(gòu)同類(lèi)物，與斑蝥素相比，缺少1，2位兩個(gè)甲基，立體構(gòu)型相同，是經(jīng)人工全合成的一種新型低毒的抗癌藥物，目前主要用于消化道腫瘤和肺癌的治療［4］。我們體外實(shí)驗(yàn)表明NCTD具有廣譜抗癌活性，特別對(duì)轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3等有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用。NCTD能夠嚴(yán)重干擾腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，使紡錘體形成紊亂，引起細(xì)胞有絲分裂期阻滯，但阻滯機(jī)制不清楚［5-6］。已知一些抗癌藥物如紫杉醇、秋水仙堿等主要通過(guò)影響微管蛋白的聚合-解聚過(guò)程，擾亂細(xì)胞的有絲分裂，從而發(fā)揮其抗癌作用［2-3］。本研究主要利用體外微管蛋白聚合-解聚反應(yīng)體系，研究NCTD對(duì)微管蛋白的聚合-解聚過(guò)程的影響，并通過(guò) NCTD敏感細(xì)胞系SK-OV-3進(jìn)行了初步的細(xì)胞水平的驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 化合物和試劑

NCTD購(gòu)于Sigma公司，使用前用無(wú)菌雙蒸水配成10 mmol·L-1的母液，-20℃保存，用前用無(wú)菌雙蒸水稀釋。2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、EGTA、ATPNa2、秋水仙堿、紫杉醇和考馬斯亮藍(lán)R250購(gòu)于Sigma公司;丙三醇、甲醇、冰醋酸、MgCl2和 NaOH等為國(guó)產(chǎn)分析純。兔抗α-微管蛋白 購(gòu)自Epitomics公司;ECL試劑盒為T(mén)hermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 微管蛋白的制備

參照文獻(xiàn)［1，7］提取微管蛋白的方法，略有改進(jìn)。將成年豬腦置于冰上，剝?nèi)ツX膜和大血管，用冷的MES 緩沖液(MES 0.1 mol·L-1，EGTA 0.1 mol·L-1，ATPNa21.0 mmol·L-1，MgCl20.1 mol·L-1，用 NaOH調(diào)pH 6.5)洗2次，然后將腦組織剪碎，每克腦組織加入1 ml MES緩沖液，在4℃條件下，用電動(dòng)勻漿器將其制成勻漿。

將腦組織勻漿在4℃，105000×g條件下離心1 h，取上清液，加入等體積的 MES聚合緩沖液(MES 0.1 mol·L-1，EGTA 0.1 mol·L-1，ATPNa21.0 mmol·L-1，MgCl20.1 mol· L-1，丙 三 醇8.0 mmol·L-1，用 NaOH 調(diào) pH 6.5)，置37℃水浴保溫30 min，期間輕輕振搖數(shù)次，在26℃，105000×g條件下離心1 h，棄上清，用約1/10勻漿體積的預(yù)冷MES緩沖液將沉淀物分散，置于冰浴中30 min，使沉淀物基本溶解。再重復(fù)低溫和高溫離心各1次，將離心得到的沉淀物，用少量預(yù)冷的 MES緩沖液在冰浴中將其溶解，得到微管蛋白溶液，置液氮中保存?zhèn)溆?。?Bradford法測(cè)定微管蛋白含量［8］。

1.3 微管蛋白的鑒定

常規(guī)10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.1%考馬斯亮藍(lán)R250染色10 min，脫色過(guò)夜。

1.4 最佳聚合微管蛋白濃度的確定

在冰浴的 96孔板中加入 5μl ATPNa240 mmol·L-1，然后加入已純化的不同濃度微管蛋白195 μl，使其終濃度分別為 5.6，2.8，1.4 和0.7 g·L-1。在4℃于酶標(biāo)儀350 nm 處迅速調(diào)零，放入37℃水浴中恒溫25 min，開(kāi)始時(shí)每隔1～3 min測(cè)定吸光度(absorbance，A350nm)1次，10 min后每隔5 min測(cè)1次，根據(jù)所測(cè)得的A530nm的變化繪制微管蛋白聚合曲線，確定微管蛋白聚合的合適濃度。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 微管蛋白聚合和解聚動(dòng)態(tài)平衡反應(yīng)

參照文獻(xiàn)［9］，在冰浴的96孔板中加入5 μl ATPNa240 mmol·L-1，然后 加 入 195 μl 濃 度 為5.74 g·L-1的微管蛋白，使其終濃度為 5.6 g·L-1。在4℃于350 nm處迅速調(diào)零，放入37℃水浴中恒溫25～30 min，開(kāi)始時(shí)每隔 1～3 min測(cè)定 A530nm，10 min后每隔5 min測(cè)定，根據(jù)所測(cè)得的A530nm的變化繪制微管蛋白聚合曲線。當(dāng)聚合曲線進(jìn)入穩(wěn)定高平臺(tái)期時(shí)，說(shuō)明微管蛋白聚合-解聚達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，吸光度不再發(fā)生顯著的變化，聚合反應(yīng)基本結(jié)束，然后，將比色皿放入4℃冰浴中25 min左右，開(kāi)始時(shí)每隔1～3 min測(cè)定 A530nm，10 min后每隔5 min測(cè)定，根據(jù)所測(cè)得的A530nm的變化繪制微管蛋白解聚曲線。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Bradford法檢測(cè)微管蛋白聚合-解聚活性

在上述微管蛋白聚合-解聚的反應(yīng)體系中實(shí)驗(yàn)組加入終濃度分別為 10，20 和 30 μmol·L-1的NCTD;參照文獻(xiàn)［9］，陽(yáng)性對(duì)照組分別加入終濃度為 2 μmol·L-1的紫杉醇和 4 μmol·L-1的秋水仙堿;空白對(duì)照組加入無(wú)菌三蒸水，按照1.5中測(cè)量方法記錄A530nm值的連續(xù)變化。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A350nm/空白對(duì)照組A350nm)×100%

1.7 Western印跡法檢測(cè)SK-OV-3細(xì)胞中微管蛋白蛋白含量

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)，本實(shí)驗(yàn)室凍存)，NCTD 60 μmol·L-1作用 8 h，分別收集對(duì)照組和藥物處理組細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取相同數(shù)量的對(duì)照組和藥物處理組細(xì)胞兩份，細(xì)胞裂解液裂解，分別做下列實(shí)驗(yàn):一份直接Western印跡法檢測(cè)對(duì)照組和藥物處理組SK-OV-3細(xì)胞中總微管蛋白含量［10］。另一份13000×g離心10 min，分別取上清(代表游離未聚合的微管蛋白)和沉淀(代表聚合的微管蛋白)，Western印跡法檢測(cè)SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)未聚合的微管蛋白和聚合的微管蛋白的含量。Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果掃描后用 Quantity One(Bio-Rad公司)軟件分析求半定量數(shù)據(jù)。比較加藥組微管蛋白含量及對(duì)照組微管蛋白含量，計(jì)算微管蛋白含量的變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 微管蛋白含量測(cè)定及微管蛋白聚合-解聚體系的建立

Bradford法測(cè)定提取的微管蛋白含量為22 g·L-1，SDS-PAGE顯示蛋白樣品的主要組分的分子質(zhì)量在55 ku左右，這與文獻(xiàn)報(bào)道的相符，用凝膠定量分析軟件Gel-Pro Analyzer Version 4.0計(jì)算微管蛋白純度約為85%。

在4組不同濃度的微管蛋白聚合曲線(圖1)中，微管蛋白濃度為5.6 g·L-1時(shí)的聚合曲線與參考文獻(xiàn)中微管蛋白標(biāo)準(zhǔn)聚合曲線一致［7］，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，故選取這個(gè)濃度作為以后實(shí)驗(yàn)濃度。

Fig.1 Polymerization of different concentration of tubulin at 37℃ from 0 to 30 min.

提取的微管蛋白在37℃水浴條件下聚合(0～25 min)，在4℃冰浴條件下解聚(25～50 min)，能夠隨溫度的變化而發(fā)生聚合-解聚(圖2)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)提取的微管蛋白具有良好的活性。

Fig.2 Polymerization of tubulin 5.6 g·L－1from 0 to 25 min at 37℃and depolymerization from 25 to 50 min at 4℃.

2.2 NCTD對(duì)微管蛋白聚合-解聚活性的影響

由圖3可見(jiàn)，紫杉醇明顯地抑制微管蛋白的解聚，且始終保持在聚合的穩(wěn)定狀態(tài)，而秋水仙堿在37℃水浴時(shí)，能夠顯著地抑制微管蛋白的聚合。

由圖4可見(jiàn)，與空白對(duì)照相比，NCTD在0～30 μmol·L-1范圍內(nèi)，在 37℃ 聚合反應(yīng)中，隨濃度的升高抑制作用增強(qiáng)(P ＜0.05)，NCTD 10，20和30 μmol·L-1組對(duì)微管蛋白聚合的抑制率分別為(5.5 ±2.7)%，(7.1 ±1.2)%和(27.5 ±0.4)%，但對(duì)微管蛋白在4℃的解聚影響不顯著。

Fig.3 Effect of colchicine and paclitaxel on tubulin polymerization.

Fig.4 Effect of NCTD on tubulin polymerization(37℃)and depolymerization(4℃).

2.3 NCTD對(duì)SK-OV-3細(xì)胞中微管蛋白聚合的影響

NCTD 60 μmol·L-1作用人卵巢癌 SK-OV-3 細(xì)胞8 h后，與空白對(duì)照組相比細(xì)胞中總的微管蛋白含量上升了(26.3 ±4.1)%(P ＜0.01)(圖 5A);而細(xì)胞中游離的微管蛋白上升了(91.5±8.5)%(P＜0.01)(圖5B);聚合微管蛋白量減少了(51.8±3.8)%(P ＜0.01)(圖5C)。表明 NCTD 對(duì)細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的聚合有明顯的抑制作用。

Fig.5 Effect of NCTD on tubulin polymerization in SK-OV-3 cells.NCTD 60 μmol·L-1treated cells for 8 h.A:total tubulin;B:free tubulin;C:polymeric tubulin.Lane 1:normal control group;lane 2:NCTD 60 μmol·L-1group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，NCTD對(duì)微管蛋白的聚合具有明顯的抑制作用，體外條件下在一定濃度范圍內(nèi)(0～30 μmol·L-1)隨濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。由于微管蛋白參與有絲分裂過(guò)程中紡錘體的形成，介導(dǎo)染色體的運(yùn)動(dòng)，當(dāng)微管蛋白的聚合作用被抑制時(shí)，藥物可能會(huì)破壞紡錘體的形成，進(jìn)而影響有絲分裂的進(jìn)程并致使腫瘤細(xì)胞增殖受阻。但體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，繼續(xù)增加NCTD的濃度，對(duì)微管蛋白的抑制作用并沒(méi)有繼續(xù)增強(qiáng)(結(jié)果中未顯示)，是NCTD與微管蛋白的結(jié)合有飽和效應(yīng)，還是高濃度的NCTD改變了微管蛋白的構(gòu)象，進(jìn)一步影響了微管蛋白的聚合過(guò)程，目前還不清楚。

另外，本實(shí)驗(yàn)的前期工作表明，NCTD在一定濃度范圍可以有效地抑制SK-OV-3細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本研究所用 60 μmol·L-1濃度在藥物有效范圍內(nèi)，目前雖發(fā)現(xiàn)在此濃度下NCTD對(duì)細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的聚合有抑制作用，但NCTD的這種作用與細(xì)胞死亡之間的確切聯(lián)系還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)證明。

NCTD對(duì)微管蛋白的作用與秋水仙堿一樣，主要抑制微管蛋白的聚合，但秋水仙堿的抑制作用遠(yuǎn)強(qiáng)于NCTD。有研究用14C標(biāo)記的秋水仙堿類(lèi)似物和內(nèi)源酶消化的方法發(fā)現(xiàn)，秋水仙堿結(jié)合于β微管蛋白的1～36和214～241的兩個(gè)殘基區(qū)段［11］，NCTD 是否與微管蛋白存在特異性結(jié)合位點(diǎn)，是否可以采取相似的方法進(jìn)行研究，還需要進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步探討NCTD結(jié)構(gòu)與其抑制微管蛋白作用之間的相關(guān)性，我們也考察了其結(jié)構(gòu)同類(lèi)物斑蝥素對(duì)微管蛋白聚合-解聚的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斑蝥素體外對(duì)微管蛋白的抑制作用與NCTD相似，在一定濃度范圍(0～20 μmol·L-1)內(nèi)具濃度依賴(lài)的正相關(guān)效應(yīng)，但同樣濃度抑制效應(yīng)比NCTD弱(結(jié)果未顯示)。NCTD與斑蝥素相比，缺少1，2位兩個(gè)甲基，立體構(gòu)型相同，說(shuō)明斑蝥素的核心結(jié)構(gòu)對(duì)微管蛋白聚合有抑制作用，而兩個(gè)甲基的存在卻削弱了斑蝥素與微管蛋白的結(jié)合。另外，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，斑蝥素對(duì)細(xì)胞的毒性大于NCTD，提示斑蝥素類(lèi)藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的途徑不僅僅是直接抑制微管聚合一條途徑。

已知斑蝥素和NCTD均為PP2A的抑制劑［12］，PP2A是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，具有多種生物學(xué)活性，是染色體分離時(shí)所需要的，有實(shí)驗(yàn)表明，在細(xì)胞水平，斑蝥素能直接或間接與PP2A結(jié)合，引起紡錘體形成紊亂，造成有絲分裂期阻滯［6］。PP2A是否直接或間接影響微管蛋白的聚合還有待進(jìn)一步研究。

［1］Shelanski ML，Gaskin F，Cantor CR.Microtubule assembly in the absence of added nucleotides［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1973，70(3):765-768.

［2］Kumar N.Taxol-induced polymerization of purified tubulin.Mechanism of action［J］.J Biol Chem，1981，256(20):10435-10441.

［3］Keates RA，Mason GB.Inhibition of microtubule polymerization by the tubulin-colchicine complex:inhibition of spontaneous assembly［J］.Can J Biochem，1981，59(5):361-370.

［4］Sun ZX，Wei YL，Zhao TD，Li JS.Studies on apoptotic cytology of K562 human myeloid leukemia cells induced by cantharidin and norcantharidin［J］.Acta Anatom Sin(解剖學(xué)報(bào))，2000，31(1):56-60.

［5］Sun ZX，Ma QW，Zhao TD，Wei YL，Wang GS，Li JS.Apoptosis induced by norcantharidin in human tumor cells［J］.World J Gastroenterol，2000，6(2):263-265.

［6］Bonness K，Aragon IV，Rutland B，Ofori-Acquah S，Dean NM，Honkanen RE.Cantharidin-induced mitotic arrest is associated with the formation of aberrant mitotic spindles and lagging chromosomes resulting，in part，from the suppression of PP2Aalpha［J］.Mol Cancer Ther，2006，5(11):2727-2736.

［7］Xu SY，Bian RL，Chen X，ed.Methodology of Pharmacological Experiments(藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué))［M］.3rd ed.Beijing:People's Medical Press.2003:1801-1802.

［8］Wang JZ，F(xiàn)an M，ed.Technical Manual for Protein(蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè))［M］.Beijing:Scientific and Technical Press，2008:42-46.

［9］Liu Y，Wu KF，Li YP.Effect of nobiletin on tubulin polymerization in vitro［J］.China J Chin Mater Med(中國(guó)中藥雜志)，2008，33(18):2113-2116.

［10］Wang HQ，Sun ZX.Effect of Pdcd4 tumor suppressor gene expression on cytotoxicity of hydroxycamptothecine［J］.World Chin J Digestol(世界華人消化雜志)，2009，17(7):647-651.

［11］Bai R，Covell DG，Pei XF，Ewell JB，Nguyen NY，Brossi A，Hamel E.Mapping the binding site of colchicinoids on beta-tubulin.2-Chloroacetyl-2-demethylthiocolchicine covalently reacts predominantly with cysteine 239 and secondarily with cysteine 354［J］.J Biol Chem，2000，275(51):40443-40452.

［12］Li YM，Casida JE.Cantharidin-binding protein:identification as protein phosphatase 2A［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89(24):11867-11870.