吳 博，江海燕，王一龍，朱加銀，趙惠玲

(溫州醫(yī)學(xué)院1.實驗動物中心，2.眼視光學(xué)院，浙江 溫州 325035)

糖尿病性腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因之一。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在DN發(fā)病中的作用已有大量研究。已往研究認(rèn)為，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)是 RAS 的核心酶，在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演關(guān)鍵角色。ACE2是近年來發(fā)現(xiàn)的第一個與ACE同源的羧肽酶，其生理作用與ACE相互拮抗。ACE2在糖尿病發(fā)生發(fā)展的不同階段對腎具有不同的影響［1-2］。目前尚未見從分子水平檢測ACE2 mRNA在腎組織的局部表達(dá)來研究藥物對DN治療機(jī)制的報道。因此，進(jìn)一步探索其發(fā)病機(jī)制，尋找更加有效的防治措施，是當(dāng)前治療糖尿病和腎病的重要課題。

番茄紅素(lycopene)是一種重要的類胡蘿卜素，廣泛存在于水果和蔬菜中，其中在番茄中的含量最高。近年來研究表明，番茄紅素具有抗氧化、抗突變、降低核酸損傷、減少心血管疾病和預(yù)防癌癥等多種藥理作用。流行病學(xué)資料顯示，人體內(nèi)番茄紅素含量過低與某些慢性疾病如動脈硬化、糖尿病和癌癥等的發(fā)生有關(guān)［3］。本研究以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)制備2型糖尿病大鼠模型，觀察番茄紅素對大鼠腎組織ACE和ACE2表達(dá)的影響，探討番茄紅素治療DN的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量200～250 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005。墊料、飲水、全價顆粒飼料及其他與大鼠接觸的物品均經(jīng)高壓滅菌處理。實驗和飼養(yǎng)條件嚴(yán)格按照SPF動物的規(guī)范要求〔SYXK(浙)2010-0150〕。

1.2 藥物、試劑和儀器

STZ，美國Sigma公司;ToxSoms番茄紅素軟膠囊，南寧富萊欣生物科技有限公司;胰島素(insulin，Ins)放射免疫試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所;血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)放射免疫試劑盒，北京華英生物技術(shù)研究所;Trizol試劑盒，美國Invitrogen公司;BcaBESTTMRNA PCR試劑盒Ver.1.1，大連寶生物工程有限公司;PCR引物合成，上海捷瑞生物工程有限公司;兔抗大鼠ACE2多克隆抗體，美國Santa Cruz公司;兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體，美國Cell Signaling Technology公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所;ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，美國Thermo公司;其余試劑均為市售分析純。

血糖儀，德國羅氏診斷公司;7600型全自動生化分析儀，日本日立公司;SN-695B型智能放免γ測量儀，上海核所日環(huán)光電儀器有限公司;722型光柵分光光度計，上海精密科學(xué)儀器公司;DU530型核酸蛋白測定儀，美國Beckman Coulter公司;PCR儀、凝膠成像儀、垂直板電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳槽，美國Bio-Rad公司。

1.3 2型糖尿病模型制備及給藥

將50只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)分組原則分為正常對照組和模型組。正常對照組(n=10)給予普通飼料喂養(yǎng)4周，不作任何處理;模型組給予高糖高脂飼料(常規(guī)飼料加20%蔗糖、10%豬油和2.5%膽固醇)喂養(yǎng)4周后空腹12 h，ip給予大鼠新配制STZ溶液30 mg·kg-1，72 h后尾靜脈采血測隨機(jī)血糖，血糖≥16.7 mmol·L-1者確定為2型糖尿病大鼠模型制備成功。將36只造模成功大鼠按體質(zhì)量和血糖水平隨機(jī)分為4組，即模型對照組、番茄紅素5，10和20 mg·kg-1組，每組9只。各番茄紅素組分別ig給予番茄紅素，每天1次，連續(xù)8周。正常對照和模型對照組均ig給予等體積色拉油。

1.4 標(biāo)本收集

給藥第8周末，大鼠禁食12 h，用10%水合氯醛3 ml·kg-1麻醉，稱體質(zhì)量后固定。每只大鼠腹主動脈采血約4 ml，1301×g離心10 min，分離血清和血漿，-20℃保存待測。每只大鼠取血后，取左側(cè)腎稱取腎質(zhì)量后置10%甲醛溶液中固定，用于病理形態(tài)檢測。右側(cè)腎迅速置液氮凍存，然后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存，以備RNA抽提、Western印跡法測定和AngⅡ含量測定。腎指數(shù)計算公式=腎質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。

1.5 血液指標(biāo)檢測

日立7600型全自動生化分析儀測定血清中血肌酐(serum creatinine，Scr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的含量。放免法檢測血漿中Ins和AngⅡ的含量。腎組織勻漿總蛋白含量的測定采用BCA法，AngⅡ的含量用AngⅡ與總蛋白的相對量表示。取尾尖血用羅氏血糖儀測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)含量。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 24 h尿蛋白定量檢測

每只大鼠分別放入大鼠代謝籠中收集24 h尿液，收集尿液前18 h禁食，正常飲水，記錄總尿量后用全自動生化分析儀測定24 h尿蛋白(urinary protein，UP)含量。

1.7 腎組織病理形態(tài)檢測

腎組織用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，分別進(jìn)行HE和PAS染色，光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)的改變。

1.8 RT-PCR檢測腎組織ACE和ACE2 mRNA表達(dá)

采用Trizol法提取腎組織總RNA，測定RNA濃度與純度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ赃m量逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，在Taq DNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物設(shè)計參照GenBank的cDNA序列，采用Primer Premier 5.0軟件，引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，95℃ 變性 30 s，56℃ 退火 30 s(ACE2 為60℃)，72℃延伸1 min，循環(huán) 35次，最后 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像并定量掃描，用Gel-Pro Analyzer分析軟件進(jìn)行圖像分析，目的基因mRNA的相對表達(dá)水平以目的基因條帶與β肌動蛋白條帶的積分吸光度(integratedabsorbance，IA)比值表示。

Tab.1 Primer sequences of rat angiotensin converting enzyme(ACE)，ACE2 and β-actin

1.9 Western印跡法檢測腎組織ACE2蛋白表達(dá)

制備10%腎組織勻漿，離心提取蛋白上清液。用BCA法測定蛋白含量后將蛋白濃度調(diào)成一致，加上樣緩沖液于100℃變性5 min，于10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h后顯影成像分析。一抗為1∶500兔抗大鼠ACE2抗體，內(nèi)參一抗為1∶3000兔抗大鼠GAPDH抗體，二抗為1∶5000羊抗兔IgG抗體。ACE2表達(dá)水平用ACE2蛋白條帶與 GAPDH條帶 IA比值表示。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 番茄紅素對糖尿病模型大鼠體質(zhì)量、腎質(zhì)量和腎指數(shù)的影響

由表2可見，與正常對照組相比，模型對照組及番茄紅素組大鼠體質(zhì)量均明顯降低，腎質(zhì)量無明顯變化，番茄紅素組腎指數(shù)顯著升高(P＜0.01)。只有番茄紅素20 mg·kg-1組大鼠腎指數(shù)顯著低于模型對照組(P＜0.05)，但仍未恢復(fù)至正常對照組水平(P ＜0.05)。

2.2 番茄紅素對糖尿病性腎病大鼠空腹血糖和胰島素含量的影響

由表3可見，與正常對照組相比，模型對照組FBG和Ins含量明顯升高(P＜0.01)。與模型對照組相比，番茄紅素治療組FBG和Ins含量均無顯著性差異，表明番茄紅素對糖代謝和Ins無明顯影響。

2.3 番茄紅素對糖尿病模型大鼠血肌酐、尿素氮、血管緊張素Ⅱ和24 h尿蛋白含量的影響

由表3可見，與正常對照組相比，模型對照組Scr，BUN，血漿及腎組織AngⅡ和24 h UP含量均顯著升高(P ＜0.01);番茄紅素10 和20 mg·kg-1能明顯降低糖尿病大鼠 Scr，BUN，血漿及腎組織AngⅡ和24 h UP水平(P＜0.05)，但都未恢復(fù)至正常對照組水平(P＜0.05)。

2.4 番茄紅素對糖尿病模型大鼠腎組織形態(tài)的影響

由圖1和圖2可見，正常對照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)規(guī)則，腎小球毛細(xì)血管基底膜、系膜和基質(zhì)未見明顯異常改變，腎小管結(jié)構(gòu)清晰(圖1A，圖2A)。模型對照組大鼠腎小管空泡樣變，管腔變窄，腎小球體積顯著增加，腎小球內(nèi)基底膜增厚，節(jié)段性系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增多，PAS染色陽性物質(zhì)增多(圖1B，圖2B)。番茄紅素治療組病變均略有減輕，表現(xiàn)為腎小球體積變小，系膜增生減輕，染色陽性物質(zhì)相應(yīng)降低(圖1C-D，圖2C-D)，且番茄紅素20 mg·kg-1組作用較明顯(圖1E，圖2E)。

Tab.2 Effect of lycopene on body mass，kidney mass and kidney index of diabetic model rats

Tab.3 Effect of lycopene on level of fasting blood glucose(FBG)，insulin(Ins)，serum creatinine(Scr)，blood urea nitrogen(BUN)，angiotensinⅡ(AngⅡ)and urinary protein(UP)of diabetic model rats

2.5 番茄紅素對糖尿病模型大鼠腎組織ACE和ACE2 mRNA表達(dá)的影響

由圖3可見，與正常對照組比較，模型對照組腎組織ACE和ACE2 mRNA表達(dá)水平降低(P＜0.01)。與模型對照組相比，番茄紅素5，10和20 mg·kg-1治療組ACE2 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05，P ＜0.01)，其中20 mg·kg-1作用更加明顯，接近正常對照組。番茄紅素5，10和20 mg·kg-1治療組ACE mRNA表達(dá)水平無明顯變化。

2.6 番茄紅素對糖尿病模型大鼠腎組織ACE2蛋白表達(dá)的影響

由圖4可見，與正常對照組相比，模型對照組腎組織ACE2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)。與模型對照組相比，番茄紅素10和20 mg·kg-1組ACE2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P ＜0.05，P＜0.01)，其中番茄紅素20 mg·kg-1作用更加明顯，接近正常對照組水平。

Fig.1 Effect of lycopene on pathological changes in renal tissue of diabetic model rats(HE staining，×400).See Tab.2 for the rat treatments.A:normal group;B:model group(→:glomerular volume increasing and tubule lumen narrowing);C-E:lycopene 5，10，and 20 mg·kg-1groups(→:glomerular volume became smaller and tubule lumen became wider).

Fig.2 Effect of lycopene on pathological changes in renal tissue of diabetic model rats(PAS staining，×400).See Tab.2 for the rat treatments.A:normal group;B:model group(→:mesangial matrix and PAS positive materials increasing);C-E:lycopene 5，10，and 20 mg·kg-1groups(→:mesangial matrix and PAS positive materials became less).

Fig.3 Effect of lycopene on angiotensin converting enzyme(ACE)and ACE2 mRNA expression in renal tissue of diabetic model rats by RT-PCR.See Tab.2 for the rat treatments.B was seniquantitative result of A.IA:integrated absorbance.M:DNA marker.1:normal control group;2:model group;3-5:lycopene 20，10，and 5 mg·kg-1groups，respectively.，n=9-10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，compared with model group.

Fig.4 Effect of lycopene on ACE2 protein expression in renal tissue of diabetic model rats by Western blotting.See Tab.2 for the rat treatments.B was the semiquantitative result of A.1:normal control group.2:model group;3-5:lycopene 20，10，and 5 mg·kg-1groups，respectively.，n=9-10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;##P ＜0.01，compared with model group.

3 討論

RAS主要是由血管緊張素原、腎素、ACE、ACE2、AngⅠ、AngⅡ及其受體以及初級或次級降解產(chǎn)物Ang-(1-7)和Ang-(1-9)等組成的具有多元生物活性的系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)血壓、調(diào)節(jié)水和電解質(zhì)平衡方面發(fā)揮重要作用［4］。目前RAS在DN發(fā)病中的作用越來越受到重視，RAS被激活是觸發(fā)DN的重要致病因素之一［5］。AngⅡ由AngⅠ在ACE的作用下水解而成，作為RAS中發(fā)揮主要生理病理作用的組分，是已知最強(qiáng)的縮血管活性物質(zhì)之一［6］。本研究結(jié)果表明，番茄紅素治療后，糖尿病模型大鼠血漿AngⅡ含量明顯低于模型對照組，提示番茄紅素可降低血漿AngⅡ水平，推測可能與其增強(qiáng)糖尿病大鼠腎臟ACE2表達(dá)水平有關(guān)。

近年來，ACE2的發(fā)現(xiàn)更新了人們對RAS的傳統(tǒng)認(rèn)識［7］。ACE2是新發(fā)現(xiàn)的一種羧肽酶，也是第一個被發(fā)現(xiàn)的ACE的同源物，主要分布于腎和心臟等器官。ACE2結(jié)構(gòu)與ACE部分相似，但在腎和心血管系統(tǒng)的作用與 ACE相反。在生理情況下，ACE2能減少 AngⅡ的生成，并能催化底物產(chǎn)生Ang-(1-7)，而Ang-(1-7)能對抗AngⅡ的作用，具有擴(kuò)血管、利尿和促尿鈉排泄、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖等作用［8］?？梢姡珹CE2和ACE作為一對高度同源的蛋白酶，在RAS中起著相互對抗和相互平衡的作用，共同參與調(diào)節(jié)循環(huán)和局部血管舒縮的平衡、維持腎血流量和水鹽代謝穩(wěn)定的過程。目前ACE2在DN進(jìn)展過程中的作用還在進(jìn)一步研究之中，傾向于具有保護(hù)腎臟的作用。

DN的早期特征主要為高灌注、高濾過和少量蛋白尿，在病理上主要表現(xiàn)為腎小球及腎臟肥大、腎小球基底膜增厚和系膜膨脹等［9］。目前有關(guān)蛋白尿產(chǎn)生機(jī)制尚不清楚，但是腎小球濾過膜結(jié)構(gòu)和功能改變是蛋白尿產(chǎn)生的重要病理基礎(chǔ)，并成為DN持續(xù)進(jìn)展的關(guān)鍵因素［10］。本研究結(jié)果表明，糖尿病模型大鼠腎組織出現(xiàn)顯著而典型的病理改變，番茄紅素治療后腎組織病理改變減輕，提示番茄紅素可以抑制糖尿病模型大鼠腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)增多。與模型對照組比較，番茄紅素治療組大鼠Scr，BUN和UP水平明顯降低，提示番茄紅素能有效地保護(hù)腎功能，延緩DN病程的發(fā)展。此外，糖尿病模型大鼠腎組織ACE基因表達(dá)與正常對照組相比降低，可能與由AngⅠ轉(zhuǎn)換為AngⅡ過程中消耗大量ACE有關(guān)，同時AngⅡ生成過多，反饋性地抑制ACE的生成。糖尿病模型大鼠腎組織ACE2表達(dá)明顯降低，相對于ACE mRNA的降低更為顯著，使得AngⅡ轉(zhuǎn)化為Ang-(1-7)的水平降低，縮血管的AngⅡ增加，舒血管的Ang-(1-7)減少［11］?？梢酝茰y，腎ACE2的表達(dá)降低將導(dǎo)致腎小管局部AngⅡ水平升高［12］，并引起腎間質(zhì)纖維增生等后續(xù)效應(yīng)。因此，ACE2在DN等腎疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮十分重要的作用，ACE2表達(dá)的降低有可能是DN形成的另一種發(fā)病機(jī)制。番茄紅素治療后，糖尿病模型大鼠腎組織ACE2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高，提示番茄紅素可能通過對ACE2的調(diào)節(jié)作用，影響了以ACE2為中心的導(dǎo)致DN發(fā)病的環(huán)節(jié)，從而延緩了DN的發(fā)生。

總之，番茄紅素具有抑制腎肥大、減輕蛋白尿和改善腎功能等作用，其治療DN的作用機(jī)制可能與增加腎組織ACE2的表達(dá)有關(guān)，具體機(jī)制需進(jìn)一步探索。

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