張 可，馬 旭，2，韓淑燕，3，馬治中，屠鵬飛

(1.北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191;2.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100083;3.北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142)

臨床研究資料表明，心肌缺血患者存在不同程度的血液流變異常。冠心病在中醫(yī)學(xué)中屬“胸痹”范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為，氣為血之帥，血為氣之母，氣行則血行，氣滯則血凝，氣虛則行血無力，導(dǎo)致血流緩慢甚至停滯，氣虛氣滯均可致血瘀。因此，血液流變各項(xiàng)指標(biāo)也是中藥研究的重要觀測內(nèi)容，特別是在中醫(yī)血瘀證的藥理研究中有重要意義［1-2］。已往研究表明，人參作為傳統(tǒng)的補(bǔ)氣藥，其單味藥及制劑可防止急性心肌梗死時(shí)冠狀動脈的高黏狀態(tài)，預(yù)防血栓形成以及動脈硬化的發(fā)生和發(fā)展，人參Rb皂苷對急性血瘀模型大鼠血液黏度、血小板聚集和血液流變的異常變化具有明顯改善作用［3］。丹參及其制劑可抑制二磷酸腺苷(ADP)和腎上腺素誘導(dǎo)的人或兔血小板聚集，體外給藥亦可抑制大鼠血小板血栓形成時(shí)間和纖維蛋白血栓形成時(shí)間，降低全血黏度、血漿黏度和纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)含量等［4-6］。人參總皂苷(saponins of Panax ginseng，EPG)是其發(fā)揮藥效的主要活性成分，丹參總酚酸(phenolic acids of Salvia miltiorrhiza，ESM)是丹參中的主要活性成分，均具有改善血液流變異常的作用。雖然關(guān)于人參和丹參在改善血液流變方面的研究頗多，但二者的配伍研究在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究以中醫(yī)“氣血理論”為指導(dǎo)，以益氣藥人參和活血藥丹參為研究對象，觀察EPG與ESM配伍對血液流變異常的改善作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

EPG為本實(shí)驗(yàn)室自制，制備工藝為:人參飲片加60%乙醇加熱回流提取4次，加醇量依次為6，4，4和4倍體積，提取時(shí)間每次均為0.5 h，合并提取液，回收乙醇后過HPD-100大孔吸附樹脂，先用6倍柱體積水洗脫，繼用8倍柱體積20%乙醇洗脫，再用6倍柱體積60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫液，濃縮，真空干燥，即得EPG，其中含人參皂苷Rg110.34%，人參皂苷Re 4.13%，人參皂苷Rg21.40%，人參皂苷Rb116.9%，人參皂苷 Rc 6.83%，人參皂苷 Rb24.73%，人參皂苷 Rb30.65%，人參皂苷 Rd 2.55%。

ESM為本實(shí)驗(yàn)室自制，制備工藝為:丹參去雜質(zhì)，切成0.5 cm左右小段，加8倍體積去離子水80℃加熱提取1 h，濾過，濾液備用，藥渣再加6倍體積去離子水80℃加熱提取2次，每次0.5 h，濾過，合并3次濾液，60℃以下減壓濃縮至相對密度為1.25～1.30(50℃)，冷卻至室溫后加95%乙醇至含醇量達(dá)80%，靜置12 h，濾過，回收乙醇，并濃縮至相對密度為1.25～1.30(50℃)，通過大孔吸附樹脂AB-8(生藥量與樹脂比例為1∶4)，用去離子水洗至流出液無糖反應(yīng)，約5倍藥材量;繼續(xù)用40%乙醇洗脫，從色帶下來開始收集洗脫液，直至洗脫液加三氯化鐵和鐵氰化鉀試劑不變綠并無沉淀為止，約8倍藥材量，將洗脫液于60℃以下減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.25～1.30(50℃)，噴霧干燥，即得ESM，其中含丹酚酸B 41.5%，丹參素2.32%，原兒茶醛4.74%，迷迭香酸4.53%，紫草酸1.91%。

阿司匹林腸溶片，購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號:BTA6E93;鹽酸腎上腺素10 mg·L-1注射液，購自天津市氨基酸公司，批號:20070612;凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin，APTT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)和Fib含量測定試劑盒均購自北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司;二磷酸腺苷，購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所。

LG-R-80B型血液黏度儀和血小板聚集凝血因子分析儀，北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司;TGL-16G A冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;3F-2型多功能微量高速離心機(jī)，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)航空工業(yè)部華興航空機(jī)輪公司。

1.2 動物和急性血瘀模型的制備

Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量240～280 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，合格證號為SCXK(京)2002-0001。大鼠sc給予腎上腺素0.8 mg·kg-1共2次，間隔時(shí)間為4 h。第1次sc給予腎上腺素 0.8 mg·kg-1后 2 h，將大鼠置于0℃冰水中游泳5 min，2 h后再第2次sc給予腎上腺素 0.8 mg·kg-1，造成大鼠急性血瘀癥［7］。

1.3 動物分組和給藥

將大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，即正常對照、模型、阿司匹林 100 mg·kg-1(陽性對照)、EPG 200 mg·kg-1、ESM 200 mg·kg-1和 EPG 200 mg·kg-1+ESM 200 mg·kg-1組。大鼠ig給予相應(yīng)藥物，正常對照和模型組大鼠ig給予等體積的空白溶劑，每天早晚各1次，共7次。于第5次給藥后，除正常對照組sc給予生理鹽水外，其余各組大鼠按1.2的方法造成大鼠急性血瘀癥后，禁食16～18 h，期間給第6次和第7次藥。最后1次給藥后30 min腹主動脈取血，肝素鈉20 kU·L-1抗凝血用于全血黏度、血漿黏度和血細(xì)胞比容的測定，3.8%枸櫞酸鈉抗凝血 (枸櫞酸鈉∶全血為1∶9，V/V)用于APTT，TT，PT 和 Fib及血小板聚集的測定。

1.4 全血黏度和血漿黏度的測定

以錐板式旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測定大鼠全血黏度。取肝素抗凝的0.8 ml全血加入血液黏度計(jì)的樣品池中，于37℃測定切變率200，100，50和1 s-1下的全血黏度，并計(jì)算紅細(xì)胞聚集指數(shù)(erythrocyte aggregation index，EAI)，即 EAI= ηa1/ηa100，其中 ηa1是切變率 1 s-1下的全血黏度，ηa100是切變率100 s-1下的全血黏度［8］。

取2 ml肝素抗凝血，3000×g離心15 min，取0.8 ml血漿于37℃測定血漿黏度。

1.5 比濁法測定血小板聚集性

取枸櫞酸鈉抗凝血2 ml，800×g離心10 min，制備富血小板血漿;再以2500×g離心10 min，制備貧血小板血漿，調(diào)節(jié)血小板密度250×109L-1，以ADP終濃度5 μmol·L-1為血小板聚集誘導(dǎo)劑，采用比濁法于37℃測定血小板最大聚集率。

1.6 APTT，TT，PT和Fib含量的測定

取枸櫞酸鈉抗凝血1 ml，3000×g離心15 min，取上層血漿，采用血小板聚集凝血因子分析儀，按測定試劑盒說明的方法于37℃測定APTT，TT，PT和Fib含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EPG與ESM配伍對急性血瘀大鼠全血黏度和血漿黏度的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠切變率在200，100，50和1 s-1下的全血黏度和血漿黏度明顯增高(P＜0.01)。與血瘀模型組相比，單獨(dú)給予 EPG 200 mg·kg-1、單獨(dú)給予 ESM 200 mg·kg-1及 EPG 200 mg·kg-1與 ESM 200 mg·kg-1配伍均可顯著降低全血黏度和血漿黏度 (P＜0.05，P＜0.01)，EPG與ESM配伍組與 EPG或ESM單獨(dú)使用組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Tab.1 Effect of extract of P.ginseng saponins(EPG)and S.miltiorrhiza phenolic acids(ESM)alone or in combination on whole blood and plasma viscosity in rats with blood stasis

2.2 EPG與ESM配伍對急性血瘀大鼠血小板聚集的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對照組相比，血瘀模型組大鼠的血小板聚集率明顯增加 (P＜0.01)。與模型組相比，EPG 200 mg·kg-1單獨(dú)使用不能顯著降低血小板聚集，ESM 200 mg·kg-1單獨(dú)使用以及EPG與ESM配伍均可顯著降低血小板聚集 (P＜0.01)，與ESM單用相比，EPG與ESM配伍抑制血小板聚集的作用無顯著性差異，而與EPG單用相比，EPG與ESM配伍組能顯著降低血小板最大聚集率(P ＜0.05)。

Tab.2 Effect of EPG and ESM alone or in combination on platelet maximum rate in rats with blood stasis

2.3 EPG與ESM配伍對急性血瘀大鼠凝血參數(shù)的影響

表3結(jié)果顯示，與正常對照組相比，急性血瘀模型組 Fib含量升高，APTT，TT和 PT顯著縮短(P ＜0.01)。與模型組相比，EPG 200 mg·kg-1能顯著降低 Fib含量，顯著延長APTT，PT和TT(P＜0.05);ESM 200 mg·kg-1能顯著降低 Fib 含量，顯著延長APTT(P＜0.05)，但對PT和TT無明顯影響。與EPG單用和ESM單用相比，EPG與ESM配伍能顯著降低Fib的含量(P＜0.05)。EPG與ESM配伍組在降低Fib含量、延長APTT和TT方面與陽性對照阿司匹林相似。

Tab.3 Effect of EPG and ESM alone or in combination on fibrinogen(Fib)，activated partial thrombin time(APTT)，thrombin time(TT)and prothrombin time(PT)in rats with blood stasis

3 討論

心肌缺血患者存在不同程度血液流變的異常，主要表現(xiàn)在Fib、血漿黏度、全血黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)升高，纖溶活性和紅細(xì)胞變形下降。血液黏度的增高會引起血流阻力增強(qiáng)，使血流速度減慢，最后導(dǎo)致血流停滯，直接影響臟器血液供應(yīng)，導(dǎo)致疾病。血液黏度主要受血漿中分子成分的影響，其中Fib是影響血漿黏度和全血黏度的主要因素之一。Fib分子為纖維狀，容易彎曲，引起分子間牽連而血液黏度增大，同時(shí)Fib通過橋聯(lián)作用連接鄰近紅細(xì)胞，使之成為可逆性緡錢簇狀的一堆聚集體，導(dǎo)致紅細(xì)胞聚集性顯著增高，原來不易聚集的部位，如微動脈或毛細(xì)血管近動脈段，也可出現(xiàn)紅細(xì)胞聚集體。當(dāng)紅細(xì)胞膜的彈性減低，而剛性指標(biāo)增高，紅細(xì)胞變硬變脆，造成組織灌注不良、缺氧和酸中毒，引起血小板聚集，這些結(jié)果又反過來加重血液黏度的增高，聚集性增高，造成惡性循環(huán)［2］。血小板是一種具有黏附、聚集和釋放等多項(xiàng)功能的細(xì)胞。在機(jī)體止血和保護(hù)血管內(nèi)皮完整性過程中起著重要作用。心肌缺血時(shí)血小板功能亢進(jìn)，形成微血栓，阻塞血流，是引起組織缺血再灌注損傷加重的重要因素。APTT可反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝血狀況;PT反映外源性凝血系統(tǒng)因子的凝血狀況。

本研究采用強(qiáng)迫游泳法讓大鼠游泳，使大鼠處于高度應(yīng)激狀態(tài)，造成大鼠體力逐步衰弱，模擬中醫(yī)所說的極度勞倦所致氣虛證的發(fā)生過程而導(dǎo)致大鼠體內(nèi)出現(xiàn)氣虛血瘀，同時(shí)腹腔注射腎上腺素致大鼠心肌缺血而得到“氣虛血瘀證”心肌缺血大鼠模型。研究結(jié)果表明，模型組大鼠全血黏度、血漿黏度、Fib含量和血小板聚集等均顯著高于正常對照組，而APTT，TT和PT則明顯低于正常對照組。EPG和ESM單獨(dú)使用均可顯著降低“氣虛血瘀證”心肌缺血大鼠的全血黏度、血漿黏度和Fib含量，顯著延長APTT，其中ESM還能顯著降低血小板最大聚集率，EPG能顯著延長TT和PT。EPG+ESM配伍改善血液流變多項(xiàng)指標(biāo)的作用均優(yōu)于EPG和ESM單獨(dú)使用，其中在降低血小板最大聚集率方面顯著優(yōu)于EPG單用，在延長TT方面顯著優(yōu)于ESM單用，在降低Fib含量上則顯著優(yōu)于EPG單用和ESM單用。EPG+ESM配伍對血液流變異常的改善作用與阿司匹林相似。由此可見，EPG和ESM單用及其配伍均能改善血瘀模型大鼠血液流變的異常，但二者配伍后能進(jìn)一步增強(qiáng)對血瘀模型大鼠血液流變異常的改善作用。

綜上所述，EPG和ESM單用及其配伍均具有糾正血液流變異常的作用，且配伍組的作用優(yōu)于EPG和ESM單用，進(jìn)一步提示在改善血瘀大鼠的血液流變方面二者可以補(bǔ)氣活血，氣血雙補(bǔ)，為臨床上聯(lián)合應(yīng)用補(bǔ)氣藥和活血藥進(jìn)行疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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