胡曉丞，李亞洲，佟繼銘，張樹峰

(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北 承德 067000)

大黃為蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatum L.)、唐古特大黃(Rh.tanguticum Maxim.ex Balf)或藥用大黃(Rh.officinale Baill)的干燥根及根莖［1］，大黃中主要成分為蒽醌類化合物，含量為3% ～5%，大部分為葡萄糖結(jié)合苷，游離苷元有大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等［2］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，大黃具有瀉下、收澀、止血、活血、抗菌、抗病毒、降血壓、收縮血管、降低血管脆性、延緩衰老等作用［2］。此外，目前幾乎所有治療急、慢性腎衰竭的中藥復(fù)方中均有大黃［3］。據(jù)統(tǒng)計，8000多種中藥制劑中約有800多種含有大黃，一般被認為其不良反應(yīng)較低，臨床應(yīng)用比較安全，大多數(shù)降脂減肥，排毒養(yǎng)顏類中成藥均含有大黃［4］，以致應(yīng)用大黃的療程過長，使大黃相關(guān)的不良反應(yīng)的發(fā)生率增高。有關(guān)文獻報道，大黃使小鼠及金黃地鼠睪丸生精小管上皮細胞層有斷脫，金黃地鼠和大鼠的性器官萎縮［4-5］;不同年齡大鼠對大黃的耐受性上存在差異，大黃不良反應(yīng)與年齡具有相關(guān)性［6］。本實驗通過長期給予大黃水提取物及總蒽醌，采用顯微鏡、ELISA和免疫組化等實驗方法檢測大黃對雄性大鼠腎及睪丸等的毒性作用，為臨床安全用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品

大黃，購自安國市長安中藥材有限公司，產(chǎn)地甘肅。藥品批號:20090902。經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所劉翠哲研究員鑒定為掌葉大黃的干燥根莖。

1.2 儀器與試劑

STP120自動組織處理機、171型組織自動包埋機和Multiskan MK3酶標儀為美國Thermo Electron公司產(chǎn)品;NIKON Eclipse 80i-尼康生物顯微鏡為上海江文信息技術(shù)有限公司產(chǎn)品;TK-218型恒溫攤片烤片機為湖北泰維醫(yī)療科技有限責任公司產(chǎn)品。

兔抗免疫組化試劑盒和兔抗Bcl-2及Bax抗體，購自北京博奧森生物科技有限公司。大鼠睪酮、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)ELISA檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.3 動物

1.4 大黃提取物的制備

1.4.1 大黃水提取物的制備

大黃藥材，粉碎為粗粉，10倍水浸泡2次，合并提取液，過濾，提取率為26.46%，配制成含生藥量為 0.24 kg·L-1藥液，備用。

1.4.2 大黃總蒽醌的制備

大黃藥材，粉碎為粗粉，加15倍水煮沸3次，每次20 min，合并提取液。用D101大孔樹脂對提取液進行精制，以70%乙醇溶液洗脫，合并洗脫液，提取率為8.78%，配制成含總蒽醌量為0.02 kg·L-1藥液，備用。

1.5 分組及給藥

8周齡SD大鼠50只，分別隨機分為正常對照組，大黃水提物 0.3，0.6，1.2 g·kg-1組及總蒽醌0.1 g·kg-1組，每組 10 只，ig給藥，給藥容積5 ml·kg-1，連續(xù)給藥 30 d。

1.6 一般狀態(tài)觀察

觀察給藥期間實驗大鼠的活動、步態(tài)、行為等一般健康情況;每周稱體質(zhì)量1次。

1.7 雌雄合籠交配

鏡檢法篩選成年發(fā)情期雌性SD大鼠，與正常對照組和大黃水提物1.2 g·kg-1組雌雄1∶1合籠交配。次日，用滴管取少量生理鹽水釋放于被檢母鼠的陰道內(nèi)，再吸出少許陰道內(nèi)容物，滴于載玻片，用光學(xué)顯微鏡在100倍下檢查，發(fā)現(xiàn)精子者為陽性(交配成功);否則為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分數(shù)表示，兩組間比較采用 χ2 檢驗；呈正態(tài)分布的計量資料以 ±s 表示，兩組間比較采用兩獨立樣本 t 檢驗，術(shù)前、術(shù)后資料的比較采用配對 t 檢驗；呈偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，兩組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。檢驗水準（α）為 0.05。

1.8 精子數(shù)量、活動率及畸變率的檢測

取大鼠一側(cè)附睪，置于盛2 ml生理鹽水的平皿中，用眼科剪將附睪縱向剪2～3刀，靜置3～5 min，輕輕搖勻，濾紙過濾后備用，然后檢查。① 活精子計數(shù):取搖勻的濾液滴入血細胞計數(shù)板按紅細胞計數(shù)法［7］計數(shù)(×1010L-1)。② 精子活動率:用伊紅活體染色法，計數(shù)6個不同視野各100個精子，計算活動精子率(%)。③精子畸形率:取精子濾液涂片，甲醇固定，用2%伊紅Y染色12 h，高倍鏡下觀察100個精子的形態(tài)，計數(shù)精子畸形率(%)。

1.9 臟器指數(shù)的計算［8］

處死大鼠剖取雙睪丸和附睪，用濾紙吸干血液，電子天平稱重，并計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。

1.10 血清中睪酮，LH和FSH的含量測定

腹主動脈取血，立即1360×g下離心10 min，取上清，將血清注入1.5 ml EP管中4℃保存?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒說明書方法測定血清中睪酮，LH和FSH的含量。

1.11 睪丸組織病理學(xué)觀察

睪丸用10%中性甲醛溶液固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，5 μm均勻切片，HE染色，觀察睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.12 免疫組織化學(xué)法［9］檢測Bcl-2和Bax表達

睪丸組織蠟塊5 μm切片、脫蠟、水化，3%H2O2溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，按照試劑盒說明的操作步驟進行DAB顯色5～8 min，水洗以終止顯色反應(yīng)，蘇木精輕度復(fù)染、自來水沖洗返藍、1%鹽酸乙醇分化、水沖洗，然后鏡檢。Bax，Bcl-2陽性產(chǎn)物表達于間質(zhì)細胞和生精細胞的胞漿及胞漿內(nèi)的棕黃色顆粒。采用圖像分析系統(tǒng)進行Bax，Bcl-2表達半定量分析，即每組隨機選取 10張切片，于 200倍鏡下隨機選擇10個生精小管，測陽性產(chǎn)物表達百分率。

1.13 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大黃提取物對動物一般情況及體質(zhì)量的影響

實驗期間，正常對照組大鼠大便正常，活動敏捷，步態(tài)、行為及對外界反應(yīng)情況正常，無死亡。大黃0.6和1.2 g·kg-1組及總蒽醌組大鼠均出現(xiàn)稀便、軟便，體質(zhì)量增長抑制，毛色暗淡，無光澤，不順滑，精神不振，尿液顏色棕黃等現(xiàn)象，其中1.2 g·kg-1組及總蒽醌組大鼠出現(xiàn)局部被毛呈紅色，尿液呈深紅色的現(xiàn)象。3周后稀便、軟便情況緩解，均無死亡。其中大黃提取物1.2 g·kg-1組及總蒽醌組大鼠反應(yīng)明顯遲緩。表1結(jié)果顯示，與正常對照組比較，大黃提取物 0.3，0.6 和 1.2 g·kg-1組及總蒽醌組體質(zhì)量增長受到了明顯抑制(P＜0.05);與大黃水提物0.3 g·kg-1相比，大黃水提取物 0.6，1.2 g·kg-1組及總蒽醌組體質(zhì)量下降率有顯著差異(P ＜0.05)。

2.2 大黃水提物對大鼠交配成功率的影響

如表2所示，與正常對照組和大黃水提物0.3 g·kg-1組相比，大黃水提物0.6和1.2 g·kg-1組和總蒽醌組交配成功率明顯降低(P＜0.05)。

Tab.1 Effect of rhubarb water extract(RWE)and rhubarb total anthraquinone(RTA)on body mass of rats

Tab.2 Effect of RWE and RTA on mating success in rats

2.3 大黃提取物對雄性大鼠精子數(shù)量、活動率和畸形率的影響

如表3所示，與正常對照組比較，大黃水提物及總蒽醌組精子數(shù)量明顯減少，活動率明顯降低(P＜0.05)，而精子畸形率無明顯差異。

2.4 大黃提取物對大鼠睪丸及附睪指數(shù)的影響

如表4所示，與正常對照組比較，大黃提取物0.6和1.2 g·kg-1組和總蒽醌組睪丸質(zhì)量明顯降低(P ＜0.05)，大黃提取物 1.2 g·kg-1和總蒽醌組附睪質(zhì)量明顯降低(P＜0.05)，大黃提取物0.3與0.6 g·kg-1組附睪質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，大黃提取物1.2 g·kg-1組和總蒽醌組睪丸指數(shù)明顯降低(P＜0.05)，但各組附睪指數(shù)與正常對照組無明顯差異。

2.5 大黃提取物對雄性大鼠血清性激素水平的影響

表5結(jié)果顯示，與正常對照組相比，大黃提取物0.3 g·kg-1組的睪酮，LH，F(xiàn)SH含量無統(tǒng)計學(xué)差異，而大黃提取物0.6，1.2 g·kg-1組及總蒽醌組的睪酮濃度均明顯降低(P＜0.05);而LH，F(xiàn)SH濃度均明顯升高(P ＜0.05)。與大黃提取物0.3和 0.6 g·kg-1組相比，大黃提取物1.2 g·kg-1組和總蒽醌組睪酮明顯降低，而LH和FSH含量明顯升高(P＜0.05)。

2.6 大黃提取物對睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響

圖1結(jié)果顯示，正常對照組的間質(zhì)細胞形態(tài)正常，生精小管基膜連續(xù)、完整，各級生精細胞形態(tài)正常，排列規(guī)則，支持細胞形態(tài)典型(圖1A)。大黃提取物0.3 g·kg-1組的間質(zhì)細胞出現(xiàn)破裂，管腔增大，但各級生精細胞仍清晰可見(圖1B)。大黃提取物0.6 g·kg-1組的間質(zhì)細胞部分破裂，生精小管管腔不規(guī)則，生精上皮細胞層次紊亂，細胞間隙增大(圖1C)。大黃提取物1.2 g·kg-1組及總蒽醌組的間質(zhì)細胞部分消失，生精小管支持細胞缺失，生精細胞間隙增大、部分缺失，細胞層明顯減少、變薄(圖1D，E)。

Tab.3 Effect of RWE and RTA on sperm count，the activity rate and malformation rate in rats

Tab.4 Effect of RWE and RTA on mass and indices of testis and epididymis in rats

Tab.5 Effect of RWE and RTA on levels of testosterone(T)，luteinizing hormne(LH)and follicle-stimulating hormone(FSH)in serum of rats

2.7 大黃提取物對Bax和Bcl-2表達水平的影響

圖2的免疫組化染色結(jié)果顯示，在大鼠睪丸間質(zhì)細胞、精原細胞及精母細胞胞漿內(nèi)見到Bax(圖2A)和Bcl-2(圖2B)表達，表現(xiàn)為棕黃色顆粒。半定量結(jié)果(表6)顯示，與正常對照組相比，大黃水提物0.3，0.6，1.2 g·kg-1組和總蒽醌組 Bax 表達明顯升高(P ＜0.05)，Bcl-2表達明顯降低(P ＜0.05)，并隨劑量增加進一步升降(P＜0.05)。

Tab.6 Effect of RWE and RTA on positive expression of Bax and Bcl-2 in spermatogenic cells

Fig.1 Effect of RWE and RTA on morphology in testis in adult rats(HE ×100).A:normal control group;B-D:RWE 0.3，0.6 and 1.2 g·kg-1groups;E:RTA 0.1 g·kg-1group.Arrows show the lose of cell layer.

Fig.2 Effect of RWE and RTA on Bax(A1－A5)and Bcl-2(B1－B5)expression in spermatogenic cells of rats(SP ×200).1:normal control group;2-4:RWE 0.3，0.6 and 1.2 g·kg-1group;5:RTA 0.1 g·kg-1group.Arrows show the positive expression product.

3 討論

大黃為中醫(yī)臨床常用藥，由于近年來不適當?shù)氖褂茫蛊洳涣挤磻?yīng)的發(fā)生率明顯增高，關(guān)于大黃不良反應(yīng)的相關(guān)報道主要集中于:①消化系統(tǒng)，可引起消化道刺激反應(yīng)，如惡心、嘔吐、胃腸絞痛等。②使用不當，過量服用可引起機體大量脫水，體內(nèi)電解質(zhì)平衡破壞，嚴重者甚至引起虛脫。③對肝腎的毒性，以大黃素和蒽醌長期超大劑量使用動物可能產(chǎn)生一定肝、腎和膀胱毒性。文獻報道，連續(xù)口服大黃制劑14周以上(大黃素:小鼠29 mg·kg-1，大鼠22 mg·kg-1;蒽醌:小鼠 250 mg·kg-1，大鼠135 mg·kg-1)，可致肝腫大、腎小管透明小滴生成和腎礦化、膀胱細胞漿改變等［10］。④ 致癌作用，以大黃素和蒽醌長期超大劑量飼喂動物可能會增加靶器官細胞癌變的潛在危險，但其致癌性尚無明確結(jié)論。有報道連續(xù)口服大黃制劑2年以上(大黃素:小鼠10 mg·kg-1，大 鼠 5.6 mg·kg-1;蒽 醌:小 鼠90 mg·kg-1，大鼠 33 mg·kg-1)，可使肝細胞瘤和腎小管腺瘤發(fā)生率增加［11-12］。⑤ 繼發(fā)性便秘。⑥ 生殖毒性，大黃可致雌性大鼠成熟期明顯減緩，子宮卵巢質(zhì)量減輕;小鼠及金黃地鼠睪丸生精小管上皮細胞層有斷脫，金黃地鼠和大鼠的性器官皆有萎縮;未成年大鼠卵巢萎縮，陰戶延期甚至長期不能洞開［4-5］。本研究說明大黃對成年雄性大鼠睪丸功能有較強的毒性，其毒性反應(yīng)程度有明顯的劑量依賴關(guān)系。

睪丸是雄性生殖系統(tǒng)的重要組成部分，其中生殖小管占睪丸體積的80%［13］。在生精小管管壁中，各種不同發(fā)育階段的生精細胞是按順次排列的，分別為精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞、分化中的精子，直至成熟精子脫離支持細胞(Sertoli細胞)進入管腔，在附睪內(nèi)精子進一步成熟并獲得運動能力［14］。其功能包括產(chǎn)生成熟的精子和合成并分泌雄性激素。因此，睪丸形態(tài)正常是維持睪丸功能正常的基礎(chǔ)。本實驗HE染色結(jié)果表明，睪丸細胞間質(zhì)和生精上皮明顯損傷，可能是導(dǎo)致大鼠生殖功能損傷的重要原因。

睪酮是C-19類固醇激素，對促進精子的生成和刺激生殖器官的發(fā)育等有重要的作用。睪丸間質(zhì)細胞的功能主要是合成和分泌睪酮，分泌的睪酮約占血漿睪酮的95%。間質(zhì)細胞的睪酮分泌有基礎(chǔ)分泌和促性腺激素誘導(dǎo)的分泌兩種形式，后者受下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)。

睪丸生殖細胞的凋亡和細胞的增殖分化受到多種基因的控制。Bcl-2基因家族是細胞凋亡的重要調(diào)控基因，其中以Bcl-2作為細胞生存基因的代表，而Bax作為細胞死亡基因的代表，二者表達水平間的平衡結(jié)果決定了細胞是生存還是死亡［15］。近年來的研究提示Bcl-2和Bax這兩種基因均參與了生精細胞凋亡的過程［16-17］。

本研究結(jié)果顯示，給藥組大鼠血清睪酮含量顯著下降，LH和FSH含量顯著升高。Bax在睪丸間質(zhì)細胞、支持細胞和精母細胞中有表達，其中間質(zhì)細胞表達最為明顯。提示大黃的生殖毒性機制可能是損傷了間質(zhì)細胞和支持細胞使睪酮合成酶和能量代謝酶活性下降，因而使睪酮合成減少，血清睪酮水平下降，促使LH升高。血中FSH升高主要是由于睪酮的下降通過下丘腦-垂體-睪丸軸的調(diào)節(jié)代償性增高，致血清中性激素的水平異常，從而影響睪丸的生精過程。

本實驗研究表明，ig給予大黃提取物30 d對成年大鼠睪丸有明顯的毒性作用，其作用靶點在睪丸的間質(zhì)細胞，其毒性的主要成分及機制有待進一步研究。

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