施建軍， 譚 瑩， 杜 斌， 錢(qián)建瑛， 馮 磊， 邱麗穎

(江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122)

合歡皮是豆科植物合歡Albizzia julibrissin Durazz的樹(shù)皮，為常用的傳統(tǒng)中藥，具有解郁安神、活血消腫之功效［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，合歡皮具有抗腫瘤作用［2］。合歡皮具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性［3-4］。在以抗腫瘤新生血管的生理活性指標(biāo)下，分離純化得到了合歡皮提取物，定性鑒別分析確定了該活性組分群為皂苷類(lèi)化合物［5］。前期實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道表明合歡皮中目前已鑒定的皂苷的苷元多為齊墩果酸［6］。由于目前尚未有通過(guò)國(guó)家鑒定的合歡皮總皂苷對(duì)照品，測(cè)定合歡皮總皂苷的方法主要是紫外分光光度法［7-8］，雖然該方法所需設(shè)備及操作簡(jiǎn)單，易普及推廣，靈敏度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性較高，應(yīng)用范圍廣;但其專(zhuān)屬性較差，對(duì)許多物質(zhì)均有顯色反應(yīng)，且易受環(huán)境因素、儀器等影響。本實(shí)驗(yàn)選用齊墩果酸為參照對(duì)照品，通過(guò)酸水解合歡皮中的總皂苷，得到齊墩果酸苷元，建立合歡皮中總皂苷的HPLC定量測(cè)定方法，以齊墩果酸的含有量代表總皂苷的含有量，同時(shí)對(duì)該方法進(jìn)行可行性分析。

1 儀器和試藥

HITACHI高效液相色譜儀，電子天平［梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司］，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，電熱恒溫水槽 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)。齊墩果酸對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供 (110709-200505)，合歡皮生藥材由無(wú)錫山禾集團(tuán)中藥飲片廠提供 (20070418)，乙腈和甲醇為色譜純，水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 原藥及樣品溶液的準(zhǔn)備

2.1.1 原藥的制備 取合歡皮，粉碎，加10倍量75%乙醇溶液，加熱回流，冷卻過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，去離子水復(fù)溶，60℃真空干燥。取干粉，加去離子水溶解，等體積水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，回收溶劑，加水復(fù)溶，60℃真空干燥，得原藥。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精確稱取齊墩果酸對(duì)照品粉末1.5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得貯備液，每1 mL含齊墩果酸0.15 mg。

2.1.3 供試品的制備 精密稱取原藥0.2 g，按2.3.2項(xiàng)單因素和2.3.3項(xiàng)正交實(shí)驗(yàn)方法制得的水解物，用甲醇定容至10 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 陰性樣品1的制備 取200 mg原藥，用甲醇定容至10 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.5 陰性樣品2的制備 原藥按2.3.2項(xiàng)方法酸解過(guò)濾后，在石油醚提取前，將沉淀直接加甲醇定容至5 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.6 陰性樣品3的制備 原藥按2.3.2項(xiàng)方法酸解后將濾液與洗液合并，加NaOH溶液將pH調(diào)至中性，減壓蒸干溶劑，加甲醇定容至5 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HPLC測(cè)定齊墩果酸方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 WondaSilTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相乙腈-水 (90 ∶10);檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;柱溫30℃;體積流量1 mL/min。理論板數(shù)以齊墩果酸計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密量取齊墩果酸對(duì)照品2、4、6、8、10、15、20 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量 (X)為橫坐標(biāo)，峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=564220X－7190.5，(R2=0.9992)。結(jié)果表明齊墩果酸在0.3～3.0 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一齊墩果酸對(duì)照品溶液(0.15 mg/mL)10 μL，在2.2.2項(xiàng)條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定齊墩果酸的峰面積，計(jì)算得其RSD為1.60%。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取不同供試品溶液6份，在2.2.1項(xiàng)條件下進(jìn)樣10 μL，測(cè)定齊墩果酸的峰面積，計(jì)算得其RSD為1.72%。

2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，在2.2.1項(xiàng)條件下分別于0、2、4、8、12、24 h內(nèi)測(cè)定齊墩果酸峰面積，計(jì)算得其RSD為1.36%。

2.2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取不同供試品溶液6份，分別精密加入齊墩果酸對(duì)照品3 mg，在2.2.1項(xiàng)條件下測(cè)定齊墩果酸峰面積，計(jì)算得平均回收率為97.91%，RSD為0.84%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 齊墩果酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 酸水解工藝考察

2.3.1 酸水解合歡皮總皂苷的工藝研究 合歡皮皂苷為齊墩果酸型皂苷，常用水解劑有甲酸、乙酸、硫酸和鹽酸等。本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察乙酸、鹽酸和硫酸的水解程度;以酸濃度、酸量、水解溫度和酸解時(shí)間4個(gè)因素為考察對(duì)象，每個(gè)因素設(shè)立3個(gè)水平 (見(jiàn)表2)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，以齊墩果酸含有量為指標(biāo)，優(yōu)選最佳的水解條件。

表2 L9(34)因素水平

2.3.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按2.1.1項(xiàng)方法取0.2 g提取物于100 mL圓底燒瓶中，各加入30 mL 1 mol/L硫酸、30 mL 2 mol/L鹽酸和30 mL 2 mol/L乙酸，85℃水浴鍋中反應(yīng)2 h。冷卻后中速濾紙過(guò)濾，將沉淀用水洗至中性，收集濾液和洗液，沉淀放于烘箱中60℃烘干。用50 mL石油醚回流提取3次，每次提取2 h，合并提取液，旋干，加甲醇復(fù)溶，旋干，最后用甲醇定容至10 mL，制備供試品溶液。由結(jié)果可知硫酸水解后所得齊墩果酸含有量最高，合歡皮總皂苷水解的程度最佳，故所選酸為硫酸。

2.3.3 正交實(shí)驗(yàn) 取9份0.2 g提取物，按表3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依次按照2.3.2項(xiàng)方法水解，制備供試品溶液。由表3可以看出，A、B、C、D對(duì)皂苷的水解影響程度不同，各因素的影響程度依次為:反應(yīng)時(shí)間 (D)＞料液比 (B)＞酸的濃度 (A)＞反應(yīng)溫度 (C)，最佳的酸水解條件為A3B2C2D3，即加入3 mol/L硫酸30 mL，85℃反應(yīng)4h。由于反應(yīng)溫度影響最小，在方差分析中將其作為誤差。從方差分析結(jié)果表明，酸的濃度 (A)和料液比 (B)對(duì)結(jié)果影響不大，反應(yīng)時(shí)間 (D)對(duì)結(jié)果有顯著性影響，由于只有一個(gè)因素有顯著性影響，因此本實(shí)驗(yàn)不考慮因素之間的交互作用，見(jiàn)表4。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表4 方差分析

2.4 方法專(zhuān)屬性和特異性考察

2.4.1 方法專(zhuān)屬性考察 按上述色譜條件分別對(duì)對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)行分析。

精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，在WondaSilTMC18柱中的保留時(shí)間為7.8 min左右，說(shuō)明在該HPLC色譜分析條件適宜，對(duì)供試品溶液的系統(tǒng)分離效果較好。

將原藥水解后的水相，即水解液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果，在齊墩果酸的保留時(shí)間內(nèi)不出峰，同時(shí)以齊墩果酸為對(duì)照品進(jìn)行TLC檢測(cè)亦無(wú)對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)出現(xiàn)，說(shuō)明水解液中不含齊墩果酸這一物質(zhì)，而全部存在于水解后的固相內(nèi)，即水解沉淀。

按2.2.1項(xiàng)色譜條件，將水解沉淀進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果，水解沉淀含有的成分過(guò)于復(fù)雜，在乙腈-水 (90∶10)條件下柱子分離齊墩果酸的效能大大降低，干擾了對(duì)齊墩果酸含有量的測(cè)定。但采用石油醚回流提取后，石油醚相的HPLC分析能在齊墩果酸保留時(shí)間內(nèi)出峰，并有較好的峰形，理論塔板數(shù)不低于1000，說(shuō)明石油醚回流提取基本能使齊墩果酸與其他物質(zhì)達(dá)到分離的效果。

2.4.2 方法特異性考察 采用紫外分光光度法和HPLC法測(cè)定原藥水解的水相溶液 (陰性對(duì)照溶液1)。HPLC法在檢測(cè)原藥水解后的水相溶液時(shí)，在齊墩果酸保留時(shí)間7.8 min左右無(wú)色譜峰，同時(shí)TLC檢測(cè)時(shí)，在齊墩果酸對(duì)照品對(duì)應(yīng)位置亦無(wú)紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)，說(shuō)明該樣品無(wú)齊墩果酸這一化合物。而紫外分光光度法檢測(cè)時(shí)有顯色反應(yīng)，且齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到40.36 mg/g(n=3，RSD為0.77%)。結(jié)果表明，HPLC法檢測(cè)齊墩果酸這一化合物，專(zhuān)屬性較強(qiáng)、準(zhǔn)確性較好。

3 討論

3.1 一種科學(xué)可行、靈敏特異的測(cè)定方法是評(píng)價(jià)藥物組分有效物質(zhì)含有量的重要工具。前期工作提取到的具有抗腫瘤新生血管生成組分，能較好抑制腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力，體內(nèi)外評(píng)價(jià)其具有良好的成藥性。為了控制提取工藝和促進(jìn)其成藥化，建立一個(gè)靈敏度高、專(zhuān)屬性好和特異性好的方法具有非常的重要意義。

3.2 本實(shí)驗(yàn)建立了總皂苷的HPLC定量分析方法，且靈敏度高，測(cè)出最低含有量為0.3 μg;通過(guò)分別檢測(cè)原藥和陰性樣品，原藥水煮液中檢測(cè)不到齊墩果酸，通過(guò)酸水解后，樣品中能檢測(cè)到齊墩果酸，說(shuō)明其方法專(zhuān)屬性好;采用紫外分光光度法測(cè)定合歡皮水解后的水相溶液，所得齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到38.04 mg/g，但是HPLC法檢測(cè)時(shí)，在齊墩果酸保留時(shí)間7.8 min左右無(wú)色譜峰，同時(shí)TLC檢測(cè)時(shí)，在齊墩果酸對(duì)照品對(duì)應(yīng)位置亦無(wú)紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)，說(shuō)明該原藥水解后的水相溶液中無(wú)齊墩果酸這一化合物，結(jié)果表明，HPLC法檢測(cè)齊墩果酸這一化合物，特異性較好。

3.3 此方法關(guān)鍵步驟為酸水解工藝，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)考察合歡皮總皂苷水解的主要因素并確定了最佳水解條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明反應(yīng)溫度對(duì)水解反應(yīng)有顯著影響。最佳水解總皂苷酸的種類(lèi)為硫酸;其最佳水解工藝為:硫酸濃度3 mol/L，料液比1∶150，水解溫度85℃，水解時(shí)間4 h。

3.4 本研究為合歡皮抗新生血管有效部位總皂苷的定量測(cè)定提供了一種可行的、靈敏性、特異性和重復(fù)性好的穩(wěn)定的方法，為合歡皮抗新生血管有效部位的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供了科學(xué)依據(jù)。

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