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        合歡皮總皂苷對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的SOD、GSH-PX活性及COX-2、CaN表達的影響

        2015-12-08 03:00:38蔡維維邱麗穎
        中成藥 2015年11期
        關(guān)鍵詞:合歡皮總皂苷小劑量

        杜 斌, 蔡維維, 馮 磊, 邱麗穎

        (江南大學無錫醫(yī)學院,江蘇無錫214122)

        合歡皮總皂苷對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的SOD、GSH-PX活性及COX-2、CaN表達的影響

        杜 斌, 蔡維維, 馮 磊, 邱麗穎*

        (江南大學無錫醫(yī)學院,江蘇無錫214122)

        目的 通過觀察合歡皮總皂苷對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的SOD、GSH-PX活性及COX-2、CaN表達的影響,研究其毒性機制。方法 實驗分為正常對照組、合歡皮總皂苷小劑量致毒組 (7.5 mg/kg)及合歡皮總皂苷大劑量致毒組 (750 mg/kg),一次性灌胃給藥,觀察給藥前及給藥14 d時小鼠自主活動次數(shù),比色法檢測腦組織超氧化物歧化酶 (SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-PX)活性,鏈霉親和素-生物素復合物 (SABC)免疫組化試劑盒檢測環(huán)氧化酶-2(COX-2)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 (CaN)的表達。結(jié)果 合歡皮總皂苷致毒劑量可降低小鼠自主活動次數(shù);與正常對照組比較,給藥組腦組織中CaN表達降低;COX-2表達增高,有顯著差異性,與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較,合歡皮總皂苷大劑量致毒組腦組織中CaN表達降低,COX-2表達增高,有顯著差異性。與正常對照組比較,給藥組腦組織中SOD和GSH-PX活性均降低,有顯著差異性;與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較,合歡皮總皂苷大劑量致毒組腦組織中SOD活性降低,GSH-PX活性增高,但無差異性。結(jié)論 合歡皮總皂苷致毒劑量對神經(jīng)系統(tǒng)有毒性作用,可能與總皂苷降低SOD、GSH-PX活性,同時增高COX-2表達、降低CaN表達有關(guān)。

        合歡皮總皂苷;神經(jīng)毒性;小鼠

        合歡皮為豆科植物合歡(Albizia julibrissin Durazz)的干燥莖皮,合歡皮中含有黃酮、三萜、多糖、木脂素、鞣質(zhì)、生物堿、甾醇、脂肪酸甘油酯、吡啶衍生物等多種化學成分。2000年版 《中華人民共和國藥典》一部收載合歡皮具有解郁安神,活血消腫的功能,說明安心神、解憂郁為合歡皮的主要功效。臨床方劑合歡湯有解郁作用,大致相當于興奮大腦皮層。用于心神不安,憂郁失眠,肺癰瘡腫,跌撲傷痛等癥[1]。文獻報道及本實驗室研究發(fā)現(xiàn)合歡皮總皂苷有顯著抗腫瘤新生血管的作用[2-3],同時發(fā)現(xiàn)一定劑量合歡皮總皂苷對腎臟、肺臟、肝臟、生殖系統(tǒng)、胃腸道等有一定的毒性[4-8]。為了促進臨床使用,需進一步探討合歡皮總皂苷對神經(jīng)系統(tǒng)的作用機制及毒性。

        1 實驗與儀器

        1.1 實驗動物 清潔級昆明種小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量20 g左右。上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,動物合格證號為滬SXK2012-0002。

        1.2 藥物和試劑 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)(南京建成生物工程研究所,批號20130530);谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)(南京建成生物工程研究,批號20130425);考馬斯亮藍 (南京建成生物工程研究所,批號20130428);細胞凋亡及環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase,COX)測定試劑盒(武漢博士德生物有限公司,批號分別為13CM400,195841);DAB顯色液A、B(批號P0203-1、P0203-2,碧云天生物技術(shù)研究所);其余試劑為國產(chǎn)分析純。合歡皮 (安徽頤生堂中藥飲片有限公司,批號120320),70%乙醇加熱提取2次,提取液濃縮至無乙醇。通過D101型大孔樹脂柱吸附后依次用水、35%和80%乙醇進行梯度洗脫,收集80%洗脫組分,冷凍干燥,所得凍干粉即為實驗用樣品。

        1.3 儀器 TG16A-WS臺式離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司);TS-8型漩渦混勻器 (江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司);DK-8B型電熱恒溫水浴槽 (上海精宏實驗設備有限公司);ME204E電子天平 (梅特勒-托利多儀器 [上海]有限公司);ELX800全自動酶標儀 (美國伯騰儀器有限公司);5804R多功能臺式離心機 (德國艾本德公司);80i正置熒光顯微鏡 (日本尼康公司);ZZ-6小鼠自主活動儀 (成都泰盟軟件有限公司)。

        2 方法

        3 結(jié)果

        3.1 合歡皮總皂苷對小鼠30 min自主活動的影響 與正常對照組比較,合歡皮總皂苷小劑量致毒組及大劑量致毒組,小鼠30 min站立和活動次數(shù)顯著降低。與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較,大劑量致毒組小鼠30 min站立和活動次數(shù)顯著降低。與給藥前比較,合歡皮總皂苷小劑量致毒組及大劑量致毒組,小鼠30 m in站立和活動次數(shù)顯著降低 (表1)??傇碥招┝恐露窘M(7.5mg/kg)及合歡皮總皂苷大劑量致毒組 (750 mg/kg),每組10只,雌雄各半。給藥劑量參照本實驗室急性毒理學研究所得的最小致毒量和最小致死量確定。禁食4 h后一次性灌胃給藥,對照組給予等體積正常。

        2.2 小鼠自主活動觀察 給藥前和給藥14 d后,成都泰盟有限公司小鼠自主活動測試儀測試小鼠30 min活動和站立次數(shù)。

        2.3 腦組織SOD和GSH-PX的測定 取腦組織相同部位的一小塊組織,用冰鹽水漂洗,吸水紙吸干,稱重,放入10 mL離心管中;加入適量的冷生理水,2 000 r/min勻漿10 s,間歇30 s,反復3次制成10%的組織勻漿;使用冷凍離心機,4℃,3 500 r/min離心10 m in,取上清液測定腦組織中SOD和GSH-PX的活性。各指標測定按照試劑盒說明書進行操作。以考馬斯亮藍法測定蛋白的量。

        2.4 SABC免疫組化試劑盒檢測COX-2、CaN陽性細胞的表達 常規(guī)脫蠟至水,根據(jù)SABC免疫組化試劑盒說明,電爐煮沸法進行抗原修復,3%H2O2滅活內(nèi)源性酶,切片于0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液 (pH 6.0),滴加正常山羊血清封閉液(50μL/片)、CaN或COX-2抗體、生物素化山羊抗小鼠抗體(50μL/片)及SABC(50μL/片),DAB顯色劑,光鏡下控制顯色時間,待細胞核呈棕黃色時,終止反應;再用蘇木精復染,逆梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。

        2.5 COX-2及CaN陽性細胞表達計數(shù) 高倍鏡下觀察,CaN的陽性細胞表達即核內(nèi)呈棕黃色。COX-2陽性細胞表達即胞漿呈棕色顆粒。每張切片隨機選10個非重疊400高倍鏡視野,計數(shù)COX-2、CaN陽性細胞數(shù)。

        2.6 統(tǒng)計學處理 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,進行單因素方差分析,組間采用t檢驗,實驗數(shù)據(jù)以

        表1 合歡皮總皂苷對小鼠30m in自主活動的影響

        表1 合歡皮總皂苷對小鼠30m in自主活動的影響

        注:與正常對照組比較,**P<0.01;與合歡皮總皂苷小劑量組比較,##P<0.01;與同組給藥前比較,△△P<0.01

        組別 劑量/(mg.kg-1) 給藥前 給藥后活動次數(shù)/次 站立次數(shù)/次 活動次數(shù)/次 站立次數(shù)/次32.60±8.33 92.40±13.97 33.20±9.93 88.10±7.48合歡皮總皂苷小劑量組 7.5 34.20±11.06 95.39±10.25 20.42±5.76**△△ 55.46±8.18**△△合歡皮總皂苷大劑量組 750 29.35±7.75 95.12±11.65 14.09±6.60**##△△ 45.83±7.77**##△△正常對照組0

        3.2 合歡皮總皂苷對腦組織SOD和GSH-PX的影響 與正常對照組比較,合歡皮總皂苷小劑量致毒組及大劑量致毒組腦組織的SOD和GSH-PX活性均顯著降低。與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較,大劑量致毒組腦組織SOD活性降

        低,GSH-PX活性增高,但無統(tǒng)計學意義 (表2)。3.3 合歡皮總皂苷對腦COX-2及CaN的影響 COX-2在正常腦組織中少有表達。與正常對照組比較,給藥組腦組織中COX-2表達明顯增高,有顯著差異性。與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較,合歡皮總皂苷大劑量致毒組的COX-2表達明顯增高,有顯著差異性 (圖1、表3)。

        表2 合歡皮總皂苷對腦組織SOD、GSH-PX活性的影響

        表2 合歡皮總皂苷對腦組織SOD、GSH-PX活性的影響

        注:與正常對照組比較,**P<0.01;與合歡皮總皂苷小劑量組比較,##P>0.05

        組別 劑量/(mg.kg-1)SOD/(U.gprot-1)GSH-PX/(U.mL-1)0 357.29±28.7 123.65±33.6合歡皮總皂苷小劑量組 7.5 162.92±29.95** 31.32±3.63**合歡皮總皂苷大劑量組 750 158.33±30.23** 37.32±5.88正常對照組**

        與正常對照組比較,給藥組腦組織中CaN表達顯著降低,有顯著差異性。與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較,合歡皮總皂苷大劑量致毒組的腦組織中CaN表達顯著降低,有顯著差異性 (圖1、表3)。

        圖1 合歡皮總皂苷對小鼠腦COX-2及CaN表達的影響(×400)

        表3 合歡皮總皂苷對腦細胞凋亡及CaN表達的影響s,n=10)

        表3 合歡皮總皂苷對腦細胞凋亡及CaN表達的影響s,n=10)

        注:與正常對照組比較,**P<0.01;與合歡皮總皂苷小劑量組比較,##P<0.01

        組別 劑量/(mg.kg-1)COX-2/(個/視野)CaN/(個/視野)5.3±0.43 43.7±3.41合歡皮總皂苷小劑量組 7.5 27.6±5.25** 32.5±3.23**合歡皮總皂苷大劑量組 750 47.1±4.25**## 25.2±4.44**##正常對照組0

        4 討論

        本實驗室已經(jīng)提取到合歡皮有效的抗腫瘤新生血管的組分和單體,但是毒性大安全范圍較?。?-10]。合歡皮乙醇提取物具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性,能明顯抑制小鼠荷瘤生長速度,延長荷瘤鼠存活時間[11]。合歡皮總皂苷通過影響細胞周期,下調(diào)pAKT、pERK的表達量,從而抑制血管形成[12-14]。其抗腫瘤作用,由于藥物劑量增大,神經(jīng)系統(tǒng)的毒性也顯現(xiàn)出來。我們在前期實驗中報道合歡皮總皂苷7.5、75、750 mg/kg劑量組對呼吸系統(tǒng)及腎臟的毒性安全評價。本次實驗結(jié)果顯示合歡皮總皂苷小劑量致毒組及大劑量致毒組腦組織的SOD、GSH-PX活性和CaN表達均降低,腦組織中COX-2表達明顯增加。過氧化損傷、自由基生成及細胞凋亡等可能為合歡皮總皂苷致神經(jīng)毒性的機制。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,SOD活性高低間接反映腦組織清除自由基的能力;GSH-PX是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶,對防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過氧化特別重要;CaN作為一種使底物脫磷酸化的蛋白磷酸酶,參與全身性應激反應引起的磷酸化反應,在維持重要器官磷酸化反應平衡中有重要意義。在過氧化損傷引起的細胞凋亡過程中,Bcl-2與COX參與了細胞凋亡的調(diào)控[4-5]。COX有兩種同工酶COX-1和COX-2。COX-1為結(jié)構(gòu)型被稱為要素酶或管家酶,主要存在于血管、胃、腎等組織中,可產(chǎn)生的PG參與機體正常生理過程和保護功能;COX-2為誘導型,是經(jīng)刺激迅速產(chǎn)生的誘導酶,即由各種損傷性化學、物理和生物因子誘導其產(chǎn)生,進而催化PGs合成參與炎癥反應。COX的表達與細胞凋亡關(guān)系密切[15],本研究通過COX-2的表達觀察合歡皮總皂苷對腦神經(jīng)的影響。黃清松等[16]報道細胞內(nèi)氧化還原與細胞凋亡有著密切的關(guān)系,本研究發(fā)現(xiàn)合歡皮總皂苷腦組織中SOD、GSH-PX活性與降低CaN的表達、增高COX-2的表達關(guān)系密切。本實驗中,合歡皮總皂苷致毒劑量使腦組織COX-2表達明顯

        增多、CaN的表達明顯減少,表明此毒性可能與降低腦組織中SOD、GSH-PX活性有關(guān)。與合歡皮小劑量組比較,合歡皮大劑量組腦組織中SOD、GSH-PX活性降低,但無統(tǒng)計學意義,而腦組織中CaN的表達減少,COX-2的表達增加,有顯著差異性。這些指標的改變可能影響給藥后小鼠30 m in站立和活動次數(shù)。上述變化有一定的劑量依賴關(guān)系,且與對照組比較有顯著性差異。說明一定劑量的合歡皮總皂苷對可致小鼠神經(jīng)毒性損傷,其損傷程度與合歡皮總皂苷的量呈正相關(guān)性,與陳小青等[17]報道一致??膳卸ê蠚g皮總皂苷類成分是合歡皮導致神經(jīng)毒性的主要物質(zhì)基礎。

        綜上所述,合歡皮總皂苷對神經(jīng)系統(tǒng)有一定毒性作用。本課題組在后續(xù)的研究中將選擇陽性藥物對照,加大對合歡皮的神經(jīng)毒性組份及作用機制的研究。

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        R285.5

        B

        1001-1528(2015)11-2514-04

        10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.040

        2014-06-13

        江蘇省中醫(yī)藥管理局康緣中醫(yī)藥科技創(chuàng)新基金項目 (HZ0816KY)

        杜 斌 (1983—),男,實驗師,研究方向為藥理學。Tel:13771560729,E-mail:dubin_41@126.com

        *通信作者:邱麗穎 (1965—),女,教授,碩士生導師,研究方向為天然產(chǎn)物的開發(fā)和中藥藥理學。Tel:(0510)85327353,E-mail:qiulydoc@sina.com

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