高 婭， 楊 潔， 楊迎春， 蘇力坦·阿巴白克力

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

紅棗Zizyphus Jujube Date為鼠李科棗屬植物棗樹(shù)Zizyphus Jujube Mill的成熟果實(shí)，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兼用品種之一［1］。紅棗中含有的三萜酸類物質(zhì)所表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性，具有對(duì)腫瘤細(xì)胞高度選擇性的特點(diǎn)，成為近年來(lái)抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白樺脂酸 (betulinic acid，BA)、齊墩果酸 (oleanolic acid，OA)和熊果酸(ursolic acid，UA)為紅棗中最具代表性且含有量較高的五環(huán)三萜類化合物，九十年代中期經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)白樺脂酸可以選擇性地殺死人類黑色素瘤細(xì)胞而不殺傷健康細(xì)胞，白樺脂酸對(duì)HIV-1型感染有抑制作用，另外近期的研究表明白樺脂酸對(duì)腦瘤、神經(jīng)外胚層瘤、白血病等惡性腫瘤細(xì)胞也有抑制作用;齊墩果酸具有較強(qiáng)的抗菌消炎作用及保護(hù)肝臟、利水滲濕等功效;熊果酸有抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，對(duì)誘癌、致癌物也有一定的抵抗作用，毒副作用小，安全性高［2］。

環(huán)核苷酸及其衍生物有10多種，其中具重要生物活性的主要為環(huán)磷酸腺苷 (adenosine 3'，5'-cyclic monophos-phate，cAMP)和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(guanosine-3'，5'-cyclic phosohate，cGMP)。在人與哺乳動(dòng)物體內(nèi)，環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷已被公認(rèn)為兩種具有反向調(diào)節(jié)作用的第二信使物質(zhì)，共同參與多種生理生化過(guò)程的調(diào)節(jié)，并可用于基因轉(zhuǎn)錄，影響蛋白質(zhì)合成。醫(yī)學(xué)研究證明至少40多種疾病 (包括癌癥、高血壓、冠心病、心肌梗塞和心源性休克等重大疾病)與環(huán)核苷酸的代謝有關(guān)。據(jù)報(bào)道，棗成熟果肉中環(huán)磷酸腺苷含有量是所有已測(cè)動(dòng)植物材料中最高的，頗具開(kāi)發(fā)價(jià)值［3］。

單獨(dú)測(cè)定白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的文獻(xiàn)已有不少，檢測(cè)方法過(guò)去多采用紙層析法、薄層層析法、紫外分光光度法、競(jìng)爭(zhēng)蛋白法等，這些方法存在著所需時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、重現(xiàn)性差、靈敏度低、人為誤差比較大等問(wèn)題，現(xiàn)在多采用高效液相色譜法 (HPLC法)進(jìn)行定量測(cè)定?，F(xiàn)代研究表明，不同品種、不同產(chǎn)地的藥材，其所含化學(xué)成分的種類及量均有較大差異，因此有必要開(kāi)展不同品種、不同產(chǎn)地紅棗中三萜類化合物和環(huán)核苷酸含有量的考察，建立快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法，有助于指導(dǎo)白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸和環(huán)核苷酸加工時(shí)選擇合適的原料，這對(duì)紅棗進(jìn)行深加工，帶動(dòng)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)，增加農(nóng)民收入將起到積極的作用。

1 儀器與試劑

LC—10Atvp高效液相色譜儀 (紫外檢測(cè)器)(日本島津公司);AL104型電子天平 (梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司);NW Ultra-pure Water System超純水儀 (力康生物醫(yī)療科技控股有限公司);KQ—250DE型數(shù)控超聲波儀 (昆山市超聲儀器有限公司)。

對(duì)照品:白樺脂酸 (上海源葉生物科技有限公司，批號(hào):YY90277)，齊墩果酸 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào) 110709-200505)，熊果酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110742-200516)，環(huán)磷酸腺苷 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)140709-200401)，環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷 (美國(guó)Sigma公司)。

甲醇 (色譜純，美國(guó) fisher scientific公司)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，磷酸、磷酸二氫鉀等其余試劑均為分析純。

新鄭紅棗、金絲小棗、狗頭棗、灘棗購(gòu)自新疆烏魯木齊七一醬園超市，其它品種采自新疆和田、阿克蘇、喀什、若羌、哈密，樣品采集后，晾干，去核，粉碎后過(guò)40目篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Shim-pack VP-ODS C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液 (90∶10，V/V);檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;體積流量0.5 mL/min;柱溫為室溫;進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 三萜酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備 分別準(zhǔn)確稱取白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸各5.00 mg，加少量甲醇溶解，移入50 mL量瓶中，用甲醇定容至50 mL，分別得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。

2.1.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取5.0 g紅棗粉，加入25 mL甲醇，70℃超聲提取20 min，過(guò)濾，濾渣再加入20 mL甲醇重復(fù)提取1次，過(guò)濾，合并兩次濾液并定容至50 mL，4000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 分別量取2.1.2項(xiàng)白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mL至 100 mL量瓶，用甲醇定容，分別得到質(zhì)量濃度為2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣20 μL，按2.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.1 Linear equations and their correlation coefficients

2.1.5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖 (圖1)。結(jié)果對(duì)照品和供試品溶液的色譜圖中，白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的保留時(shí)間一致。經(jīng)計(jì)算，理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子等各項(xiàng)指標(biāo)均符合《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VID關(guān)于系統(tǒng)適用性的規(guī)定。

2.2 環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Shim-pack VP-ODS C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀 (10∶90，V/V);檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;體積流量0.8 mL/min;柱溫為室溫;進(jìn)樣量 20 μL。

圖1 對(duì)照品 (A)和樣品溶液 (B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substance solution(A)and sample solution(B)

2.2.2 cAMP和cGMP標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備 分別準(zhǔn)確稱取 cAMP、cGMP各5.00 mg，加入2 mL超純水溶解，搖勻，定容于5 mL量瓶中，即得質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的cAMP、cGMP標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

2.2.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取5.0 g紅棗粉，加入25 mL超純水，70℃超聲提取30 min，過(guò)濾，濾渣再加入20 mL超純水重復(fù)提取1次，過(guò)濾，合并兩次濾液并定容至50 mL，8000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 分別精密量取2.2.2項(xiàng)的cAMP、cGMP標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、5.0、10.0 mL至100 mL量瓶，用甲醇定容，分別得到質(zhì)量濃度為 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣20 μL，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸，回歸方程和線性范圍見(jiàn)表1。

2.2.5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖 (圖2)。結(jié)果對(duì)照品和供試品溶液的色譜圖中，環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的保留時(shí)間一致。經(jīng)計(jì)算，理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子等各項(xiàng)指標(biāo)均符合《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VID關(guān)于系統(tǒng)適用性的規(guī)定。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 分別吸取白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸及環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液各20 μL，按2.1.1項(xiàng)和2.2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，分別以白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的峰面積計(jì)算，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)依次為 1.41%、1.24%、1.08%、0.94%和1.43%(n=5)，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5份同一批紅棗粉5.0 g，按2.1.3項(xiàng)和2.2.3項(xiàng)方法制備樣品溶液并進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷，RSD分別為1.9%、1.8%、1.9%、1.8%和 0.9% (n=5)，表明方法的重現(xiàn)性良好。

圖2 混合對(duì)照品 (C)和樣品溶液 (D)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substancs solution(C)and sample solution(D)

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批紅棗樣品溶液，每隔1 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣8次，測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)下白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷峰面積及RSD值。結(jié)果，白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷峰面積的RSD分別為 2.1%、2.3%、2.1%、1.5%和 2.0%(n=8)，表明樣品溶液至少在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取紅棗粉5.0 g，按2.1.3項(xiàng)和2.2.3項(xiàng)處理樣品，分別加入不同濃度的白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷標(biāo)準(zhǔn)貯備液，按2.1.1項(xiàng)和2.2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.7 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地的紅棗粉，按2.1.3項(xiàng)和2.2.3項(xiàng)制備方法和2.1.1項(xiàng)和2.2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 結(jié)論

通過(guò)SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行均值方差分析，從所測(cè)定的15個(gè)樣品紅棗中可以看出，不同品種、不同產(chǎn)地紅棗中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的含有量均存在顯著性差異 (P＜0.05)，以開(kāi)發(fā)棗三萜酸和環(huán)核苷酸為目的的功能性食品和保健品應(yīng)該注意棗品種的選擇。在所測(cè)定的15個(gè)樣品中，河南新鄭紅棗中白樺脂酸和齊墩果酸含有量最高，為632.83 μg/g和202.10 μg/g;山東金絲小棗和和田駿棗中齊墩果酸的含有量之間差異不顯著 (P＜0.05)，但與其它品種間均存在顯著性差異;河北滄州金絲小棗中熊果酸含有量最高，為374.23 μg/g;阿克蘇駿棗中環(huán)磷酸腺苷含有量最高，為285.44 μg/g;和田駿棗中環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷含有量最高，為56.63 μg/g。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of recovery experiments(n=6)

表3 不同產(chǎn)地紅棗粉中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的測(cè)定結(jié)果Tab.3 Contents of BA、OA、UA、cAMP and cGMP in Jujube of different cultivars

同一產(chǎn)地不同品種間5種成分的含有量也存在顯著性差異，如阿克蘇駿棗中5種成分的含有量均高于灰棗和金昌一號(hào);即使是同一品種，由于地域的不同，受環(huán)境影響，5種成分的含有量也有明顯差異，如灰棗中，喀什澤普縣的含有量均高于阿克蘇和若羌地區(qū)，為阿克蘇灰棗含有量的2.23倍。同一品種不同等級(jí)之間也存在顯著性差異，如若羌紅棗，且次級(jí)棗中環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的含有量均高于優(yōu)級(jí)棗，此結(jié)論與文獻(xiàn) ［3］報(bào)道一致。

所測(cè)3種三萜酸在各品種之間的基本規(guī)律是白樺脂酸含有量最高，其次為熊果酸，再次為齊墩果酸。環(huán)磷酸腺苷的含有量明顯高于環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷。

4 討論

目前，關(guān)于HPLC法測(cè)定白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷已有報(bào)道，根據(jù)已有資料表明檢測(cè)三萜酸的流動(dòng)相多數(shù)為甲醇-水-酸或者乙腈-水-酸。由于三萜酸類化合物呈弱酸性，在中性或堿性條件下易電離，因此分別采用磷酸鹽體系、磷酸、冰醋酸調(diào)整流動(dòng)相的酸堿性。通過(guò)對(duì)流動(dòng)相分離條件進(jìn)行選擇后發(fā)現(xiàn)，等度洗脫的分離效果并不亞于梯度洗脫方式，冰醋酸本身具有洗脫能力，磷酸廉價(jià)易得且分離效果較好，考慮到實(shí)驗(yàn)成本等因素，最終選擇甲醇-水體系，并用磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的酸堿性，恒梯度洗脫方式。

王向紅［3］等從阜平大棗不同等級(jí)樣品分析結(jié)果來(lái)看，齊墩果酸和熊果酸的含有量似乎與品質(zhì)之間不存在明顯相關(guān)性，本研究通過(guò)對(duì)新疆若羌灰棗不同等級(jí)樣品中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸含有量進(jìn)行分析，其結(jié)論與本研究結(jié)果一致。

郜文等［6］測(cè)定陜西省紅棗中 cAMP含有量為62.9 μg/g，與本次測(cè)得陜西狗頭棗 (80.91 μg/g)的結(jié)果差異不大;王向紅［3］等曾對(duì)10余個(gè)棗品種中cAMP和cGMP含有量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明駿棗中cAMP的含有量明顯高于其它品種，與本研究結(jié)果一致，其中三變紅棗中cGMP含有量最高，為17.2 μg/g，其次為婆婆棗，其它棗品種的含有量約在0.63 μg/g～3.44 μg/g之間，本研究幾個(gè)其它省區(qū)棗品種的含有量均符合此范圍，但新疆棗品種cGMP的含有量明顯高于其它幾個(gè)省區(qū)，和田駿棗含有量最高，為56.63 μg/g;蘇豫梅等［5］測(cè)定新疆阿克蘇灰棗和駿棗中cAMP含有量分別為170 μg/g與260 μg/g，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異，初步分析其原因可能與不同的采樣時(shí)間、采樣地點(diǎn)、提取方法等有關(guān)，對(duì)于這些影響因素還有待于進(jìn)一步的研究。

本研究對(duì)15種紅棗中3種三萜酸及環(huán)核苷酸活性成分進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)于提高棗及棗類產(chǎn)品的附加值、選育高三萜酸含有量和高環(huán)核苷酸含有量棗品種以及開(kāi)發(fā)棗的功能食品和保健品都具有重要意義。

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