鄭永彪， 汪曉娟， 韓曉萍

(1.青海省食品藥品檢驗(yàn)所，青海西寧810016;2.青海省制藥廠，青海西寧810003)

冬蟲夏草是我國著名的珍貴中藥，為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.寄生在蝙蝠娥科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體［1］;主要含多種氨基酸、核苷類 (腺苷、尿苷、鳥苷)、冬蟲夏草甾醇、糖醇類 (β-谷甾醇、麥角甾醇、D-甘露醇)、脂肪酸、酯、烷烴等成分［2］。

冬蟲夏草干燥品收載于《中國藥典》2010年版一部，標(biāo)準(zhǔn)中有性狀和高效液相色譜法測定腺苷，規(guī)定腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.010%［3］;冷凍保鮮冬蟲夏草系新采挖的冬蟲夏草除去似纖維狀的附著物及泥土等雜質(zhì)，快速進(jìn)行沖洗、清潔和甩干，然后冷凍、密封貯藏，為青海南英雪線王冬蟲夏草生物科技有限開發(fā)的新型加工品。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，在同一色譜條件下能同時對尿苷和腺苷進(jìn)行定量測定，且在冷凍保鮮冬蟲夏草中，尿苷的含有量遠(yuǎn)高于腺苷，10批樣品的分析結(jié)果顯示尿苷含有量約為腺苷的5倍以上，故為有效全面地控制藥材質(zhì)量，體現(xiàn)中藥整體用藥的物質(zhì)基礎(chǔ)的優(yōu)越型，本研究建立了冷凍保鮮冬蟲夏草中腺苷和尿苷同時測定的HPLC方法，該法簡便可行，精確可控，可用于冷凍保鮮冬蟲夏草的質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀，Waters2998二極管陣列檢測器，Empower 2工作站;Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent 1100 LC/MSD trap質(zhì)譜儀;METTLER AB204電子天平;水浴鍋;超聲波震蕩器;密理博超純水器。

1.2 試藥 冬蟲夏草藥材10批 (批號分別為1～10，青海南英雪線王冬蟲夏草生物科技有限公司提供)，腺苷對照品 (879-200001，中國藥品生物制品檢定所)，尿苷對照品 (887-200001，中國藥品生物制品檢定所)，乙腈和甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［4-5］色譜柱為 Waters sunfire(250 mm×4.6 mm，5 μm);以水為流動相A，以乙腈為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫;檢測波長為260 nm;柱溫35℃;理論塔板數(shù)按尿苷峰計算應(yīng)不得低于3000。

表1 梯度洗脫順序

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取尿苷對照品20 mg和腺苷對照品2 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，制得每1 mL約含尿苷20 μg、腺苷2 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品 (自然晾干，并同步測定水分)粉末0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱質(zhì)量，超聲提取45 min(250 W，40 KHz)，取出，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，棄取初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL置于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣用水溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得［6］。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性和專屬性考察 分別精密吸取上述兩種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定即可。色譜圖見圖1，表明在該色譜條件下，尿苷和腺苷分離良好，說明樣品的處理方法能很好的去除雜質(zhì)對目標(biāo)色譜峰測定的干擾。

圖1 供試品和對照品的色譜圖

同時用LC-MS方法對上述兩種溶液中的目標(biāo)峰進(jìn)行了一致性指認(rèn)。液相參數(shù)同上述2.1項(xiàng)，質(zhì)譜參數(shù)為［7-8］:ESI源，霧化氣 (N2)體積流量為4.5 L/min，干燥氣體為12 L/min，干燥溫度380℃，掃描范圍為100～400 m/z，正離子掃描模式，在此色譜條件下的峰指認(rèn)結(jié)果見表2，供試品溶液和對照品溶液中目標(biāo)物質(zhì)具有一致性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在相應(yīng)的色譜峰位置無雜質(zhì)干擾。

表2 峰質(zhì)譜指認(rèn)結(jié)果

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取尿苷對照品5.31 mg，腺苷對照品6.18 mg，分別置于50 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得 (每1 mL含尿苷 106.2 μg，腺苷123.6 μg)，分別精密量取尿苷16.0 mL和腺苷2.0 mL，置50 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液 (每1 mL含尿苷33.98 μg，腺苷4.944 μg)。分別精密吸取此混合對照品溶液 1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL加水稀釋并定容到10 mL，得一系列對照品溶液;按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣量10 μL，記錄相應(yīng)的進(jìn)樣量和峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計算回歸方程，結(jié)果見表3。

表3 尿苷和腺苷的線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，在所測的進(jìn)樣范圍內(nèi)，尿苷和腺苷的進(jìn)樣量與峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度考察 分別精密吸取2.2項(xiàng)下的混合對照品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積值，結(jié)果尿苷和腺苷的RSD值分別為0.41%、0.63%，結(jié)果表明，本方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取冷凍保鮮冬蟲夏草藥材樣品 (樣7)，按2.3項(xiàng)制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下，分別于0、6、12、18、24、30、36、48 h進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量 10 μL，記錄峰面積，結(jié)果尿苷和腺苷的 RSD值分別為0.87%、1.5%。結(jié)果表明，制備的供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定，且穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取冷凍保鮮冬蟲夏草藥材樣品 (樣7)5份，精密稱定，按2.3項(xiàng)供試品溶液制備法提取，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析測定，分別計算尿苷和腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明，尿苷和腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.161%(RSD為0.54%)、0.0166%(RSD為1.0%)，證明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取冷凍保鮮冬蟲夏草藥材樣品 (樣7)6份，每份取0.1 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)供試品溶液制備法提取，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，尿苷和腺苷的平均回收率分別為98.70%(RSD為0.48%)、97.39%(RSD為1.6%)，證明本方法精確度良好。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.10 結(jié)果 按所建立的測定方法，對10批冷凍保鮮冬蟲夏草進(jìn)行測定，結(jié)果表明:10批冷凍保鮮冬蟲夏草中按干燥品計，尿苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.129%～0.176%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.159%;腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.0143%～0.0300%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0232%，結(jié)果均在此測定方法的線性范圍內(nèi)。

上述實(shí)驗(yàn)表明，該方法樣品處理簡便，回收率好，精密度，重復(fù)性均符合有關(guān)要求，可用于冷凍保鮮冬蟲夏草的質(zhì)量控制。

3 討論

3.1 根據(jù)上述定量測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，10批冷凍保鮮冬蟲夏草中腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.0143%～0.0300%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0232%，高于2010年版《中國藥典》中的限量0.010%;由于核苷類成分為生物代謝產(chǎn)物，其含有量越高表明越多的蟲體組織轉(zhuǎn)變成了菌絲體［9］。

3.2 在前期對冬蟲夏草干燥品指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上［10］，比較了這10批冬蟲夏草新鮮品色譜圖與原來干燥品指紋圖譜的區(qū)別，見圖2，發(fā)現(xiàn)在相同稱樣量下冷凍保鮮冬蟲夏草中色譜峰的數(shù)量和面積均大于干燥品，表明冷凍保鮮冬蟲夏草具有較好的起效物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 冷凍保鮮冬蟲夏草和干燥品的圖譜比較

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