趙 璇，王 蘭，鄭慧媛，崔媛媛，吳志新，石明娟

(西安醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，陜西 西安 710021)

衰老是機體各組織、器官功能隨年齡增長而發(fā)生退行性變化的過程。目前對實驗性衰老大鼠或老年大鼠的研究多集中在模型動物的認知功能變化及相關(guān)機制研究方面;對于老年大鼠運動功能變化及相關(guān)機制研究較少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)雌性老年大鼠的紅核NGF(nerve growth factor)陽性神經(jīng)元數(shù)目及其高親和力受體TrkA陽性神經(jīng)元數(shù)目均較青年組大鼠顯著減少[1]。紅核(red nucleus，RN)為重要的錐體外系核團，位于中腦腹側(cè)部，介于中央灰質(zhì)與內(nèi)側(cè)丘系之間，其主要功能是調(diào)節(jié)肌緊張和屈肌反射。對SD大鼠紅核神經(jīng)元的超徽結(jié)構(gòu)進行電鏡觀察證明紅核神經(jīng)元隨增齡確實存在著一定的形態(tài)學改變[2]。神經(jīng)生長因子(NGF)屬神經(jīng)營養(yǎng)因子家族，其在神經(jīng)元的存活、發(fā)育、生長和突觸可塑性方面顯示出了重要作用。成熟 NGF(mNGF，mature NGF)由其前體Pro-NGF裂解而來，mNGF和其受體TrkA相結(jié)合而發(fā)揮營養(yǎng)神經(jīng)元作用;而Pro-NGF和其受體p75NTR結(jié)合后，則誘導神經(jīng)元凋亡。對衰老大鼠基底前腦、海馬的研究表明:神經(jīng)元mNGF及TrkA的表達減低和Pro-NGF及其受體p75NTR、復合受體sortilin的表達增高密切相關(guān);進一步的研究表明Pro-NGF的表達增高可誘導其受體p75NTR表達增高、降低TrkA的表達，并誘導神經(jīng)元的退行性變[3]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本實驗研究雌性老年大鼠在運動功能方面的變化，同時研究雌性老年大鼠的紅核mNGF、TrkA表達與Pro-NGF及其受體p75NTR、復合受體sortilin的表達的關(guān)系，探索老年大鼠紅核NGF及其相關(guān)受體的增齡性變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

20只22月齡、體重320～340 g雌性SD大鼠作為老年組，20只3月齡、體重220～240 g的雌性大鼠作為青年組。動物由西安交通大學動物實驗中心提供。

1.2 主要儀器和試劑

網(wǎng)屏(50 cm×40 cm×30 cm鐵絲網(wǎng)箱，四周為木板框，網(wǎng)眼1 cm×1 cm，中山大學儀器廠制)，平衡木(直徑2.5 cm，未打磨，中山大學儀器廠制)，尼龍繩(直徑 0.5 cm，自制)。兔抗鼠 NGF、兔抗鼠p75NTR、兔抗鼠 sortilin抗體均購自 Santa Crutz公司;兔抗鼠TrkA、β-actin抗體和兔SABC試劑盒購自武漢博士德公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自Pierce公司;RIPA裂解液、BCA法蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE低分子量標準蛋白質(zhì)購自北京百泰克公司;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和硝酸纖維素(NC)膜購自Sigma公司。

1.3 大鼠運動功能實驗

先將大鼠放于直徑約1 m的盆中活動5 min，然后進行測試。①網(wǎng)屏握持試驗:將鐵絲網(wǎng)箱水平放置，距離地面60 cm。將大鼠置于網(wǎng)箱底部后，迅速將網(wǎng)箱翻轉(zhuǎn)90℃，使其底部與地面垂直。記錄大鼠握持網(wǎng)箱的時間，允許最長時間為15 s。②抓握牽引試驗:將直徑0.5 cm的尼龍繩水平系于距地面60 cm處。把大鼠前肢置于繩上后松手，不論后肢是否置于繩上，記錄其懸掛于繩上的時間，允許最長時間為20 s。③平衡木試驗:將木棒水平放置于支架，距離地面60 cm，支架間距70 cm。將大鼠放于木棒中央后松手，記錄其落下時間，允許最長時間為30 s。

1.4 Western Blot檢測

運動功能實驗結(jié)束之后，立即將大鼠麻醉，取腦，液氮速凍，貯存于-80℃冰箱備用。取灰結(jié)節(jié)中線至小腦前緣腦組織行連續(xù)冠狀冰凍切片(30 μm)，參考 Joachim F.R.K?nig版鼠腦圖譜從切片中取出紅核部位腦組織。將每組所分離組織混合后，與RIPA裂解液(含1 mmol/L的PMSF)按比例混合后勻漿，提取蛋白，應用BCA法進行蛋白含量測定，并將各組樣品濃度調(diào)為一致。對變性蛋白質(zhì)進行Western Blot檢測。一抗為:NGF、TrkA、p75NTR、sortilin和β-actin抗體，濃度為1∶200，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶500)。

1.5 統(tǒng)計學處理

全部數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩組間差異用SNK法檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異。各種數(shù)據(jù)均以表示。Western Blot實驗中用JY02S凝膠圖像分析系統(tǒng)測定各蛋白條帶的平均光密度和面積，以二者的乘積表示各蛋白的表達量。每個樣本做3次，求平均值，以目的條帶與β-actin表達量的比值表示目標蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)屏握持、抓握牽引及平衡木試驗

在3項測試中，老年組大鼠與青年組大鼠相比，最長停留時間均有顯著差異(P＜0.05)(見表1)。網(wǎng)屏握持試驗中，老年組大鼠上肢力量明顯減弱，脫網(wǎng)屏的上肢左右側(cè)概率大約相同;抓握牽引試驗中，8只老年組大鼠后肢未能置于繩上，青年組大鼠后肢都可置于繩上;平衡木試驗中，老年組大鼠平衡感覺較差，墜落較快，青年組大鼠的停留時間明顯長于老年組。

表1 兩組網(wǎng)屏握持、抓握牽引及平衡木試驗最長停留時間(s，，n=10)

表1 兩組網(wǎng)屏握持、抓握牽引及平衡木試驗最長停留時間(s，，n=10)

#P ＜0.05

平衡木最長停留時間青年組組別 網(wǎng)屏握持最長停留時間抓握牽引最長停留時間12.6 ±2.3 16.7 ±2.8 11.8 ±1.9老年組 9.6 ±3.6# 11.7 ±3.2# 7.4 ±3.0#

2.2 Western Blot結(jié)果

2.2.1 Pro-NGF 和 mNGF 蛋白的變化

本實驗所用的兔抗鼠NGF抗體可同時識別Pro-NGF和 mNGF，Pro-NGF在 32 kDa條帶處，而mNGF在14 kDa條帶處。結(jié)果表明:在紅核中，與青年組大鼠相比，老年組大鼠Pro-NGF表達水平上升，而mNGF表達水平下降(見圖1)。兩組相比有統(tǒng)計學意義，P ＜0.05。

圖1 Pro-NGF、mNGF在青年組和老年組大鼠紅核中的表達1、2、3 是青年組，4、5、6 是老年組

2.2.2 NGF受體和 Sortilin蛋白的變化

在紅核中，相對于青年組大鼠，老年組大鼠的TrkA表達水平明顯下降(見圖2)，而老年組大鼠紅核中p75NTR、sortilin的表達水平明顯上升(見圖3、4)。兩組相比均有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。

圖2 TrkA在青年組和老年組大鼠紅核中的表達1、2、3 是青年組，4、5、6 是老年組

圖3 p75NTR在青年組和老年組大鼠紅核中的表達1、2、3 是青年組，4、5、6 是老年組

圖4 Sortilin在青年組和老年組大鼠紅核中的表達1、2、3 是青年組，4、5、6 是老年組

3 討論

研究表明NGF對坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運動神經(jīng)元AchE活性恢復有促進作用，從而對運動神經(jīng)元起一定的保護作用和促進恢復作用[4]。正常情況下mNGF結(jié)合于高親和力受體TrkA發(fā)揮其維持神經(jīng)元生長發(fā)育及正常功能的作用;proNGF主要和其高親和力受體p75NTR特異性結(jié)合從而誘導神經(jīng)元凋亡[5]。進一步研究表明，proNGF和其受體p75NTR及sortilin形成三聚體發(fā)揮其誘導細胞凋亡的作用[6]。

在衰老過程中不但有認知、記憶功能的衰退，運動功能、協(xié)調(diào)平衡能力也逐漸出現(xiàn)衰退。本實驗證明:老年大鼠在網(wǎng)屏握持、抓握牽引及平衡木試驗中明顯差于青年組大鼠，其前肢力量及平衡感覺明顯衰退。在嚙齒類動物，紅核脊髓束軸突終末分部于下頸髓前角，與其內(nèi)的運動神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，參與支配前肢關(guān)節(jié)運動[7]。對SD大鼠紅核神經(jīng)元進行電鏡觀察發(fā)現(xiàn):紅核神經(jīng)元核周體中脂褐素隨增齡增多，其附近線粒體的形態(tài)有所改變，核周體中其他細胞器隨增齡也有一定程度的形態(tài)改變;并且隨增齡出現(xiàn)核膜內(nèi)折現(xiàn)象及微絲纏繞線粒體群的現(xiàn)象[2]。以上結(jié)果表明:老年大鼠運動功能、協(xié)調(diào)平衡能力的衰退和紅核神經(jīng)元的衰退相關(guān)。

前期應用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)雌性老年大鼠的紅核NGF陽性神經(jīng)元數(shù)目及TrkA陽性神經(jīng)元數(shù)目均較青年組大鼠顯著減少[1]。這提示NGF和其受體TrkA表達和大鼠紅核的增齡性衰退及運動功能衰退密切相關(guān)。但免疫組化應用的兔抗鼠NGF抗體不能區(qū)分mNGF和proNGF，更為重要的是mNGF和proNGF對神經(jīng)元的作用是截然不同的。為明確老年大鼠紅核中NGF及其相關(guān)受體變化的具體機制，本研究應用WesternBlot技術(shù)，結(jié)果表明:在紅核中，相對于青年組大鼠，老年組大鼠的Pro-NGF表達水平上升，而mNGF表達水平下降;同時老年組大鼠的TrkA表達水平明顯下降，p75NTR、sortilin的表達水平明顯上升。以上結(jié)果提示:老年大鼠紅核中NGF信號途徑的變化和老年大鼠運動功能的衰退相關(guān);同時為針對NGF信號途徑特殊靶點的藥物開發(fā)提供了線索。

[1]趙璇，李媛潔.雌性老年大鼠部分腦區(qū)NGF、BDNF、Trk A和Trk B表達的變化[J].陜西醫(yī)學雜志，2012，41(3):285-288.

[2]張兵，侯家驥，高峻，等.大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰老的形態(tài)學研究-紅核神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)改變[J].神經(jīng)解剖學雜志，1997，13(4):335-338.

[3]Fortress AM，Buhusi M，Helke KL，et al.Cholinergic Degeneration and Alterations in the TrkA and p75NTR Balance as a Result of Pro-NGF Injection into Aged Rats[J].J Aging Res，2011:1-10.

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[5]Underwood CK，Coulson EJ.The p75 neurotrophin receptor[J].Int J Biochem Cell Biol，2008，40(9):1664-1668.

[6]Al-Shawi R，Hafner A，Olsen J，et a1.Neurotoxic and neurotrophic roles of proNGF and the receptor sortilin in the adult and ageing nervous system[J].Eur J Neurosci，2008，27(8):2103-2114.

[7]Küchler M，F(xiàn)ouad K，Weinmann O，et al.Red nucleus projections to distinct motor neuron pools in the rat spinal cord[J].J Comp Neurol，2002，448(4):349-359.