王曉蓉，苑洪菲，王黎娜，于 波

環(huán)境污染物是造成不孕、流產(chǎn)和胎兒畸形的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，早期胚胎發(fā)育階段對(duì)環(huán)境污染物更加敏感［1］，明確其致病機(jī)制，尋找有效的監(jiān)測(cè)和預(yù)防手段一直為臨床所關(guān)注。甲氧滴滴涕作為一種替代滴滴涕的有機(jī)氯殺蟲劑目前在許多國(guó)家得到廣泛應(yīng)用，近年研究發(fā)現(xiàn)MXC 具有多方面的毒性作用，尤其以生殖毒性引人注目［2］。研究表明，MXC 是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)，具有雌激素樣作用，胚胎和胎兒是MXC 最敏感的靶器官之一，MXC 體內(nèi)羥基代謝產(chǎn)物的雌激素樣作用強(qiáng)于MXC。MXC 的毒性作用機(jī)制與ERα 密切相關(guān)，其代謝產(chǎn)物是ERα 的激動(dòng)劑，可以通過ERα 介導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)可以改變不同組織ERα 的表達(dá)水平［3，4］。然而，有關(guān)MXC 影響早期胚胎發(fā)育的研究報(bào)道較少，筆者通過構(gòu)建孕鼠早期胚胎發(fā)育MXC 染毒模型，檢測(cè)MXC 染毒對(duì)孕鼠胎盤組織ERα 表達(dá)的影響，探討MXC 影響雌性生殖健康和胚胎發(fā)育的毒性作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠60 只(雌性40 只，雄性20 只)，8 周齡，平均體重(28.12 ±3.3)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由飲食、飲水，清潔級(jí)飼養(yǎng)。

1.2 試劑及儀器 MXC(批號(hào):49054，純度:99%，Sigma 公司)，芝麻油(批號(hào):S3547，Sigma－Aldrich公司)、雌二醇(批號(hào):10006315，純度＞98%，Cayman Chemical 公司)、兔抗鼠ERα 單克隆IgG 抗體(Santa Cruz 公司)、Trizol 總RNA 抽提試劑盒(Invitrogen 公司)、RT 試劑盒(Invitrogen 公司)、DAB 顯色試劑盒(武漢Boster 生物工程公司);ABI7300 Real－Time PCR 檢測(cè)儀(ABI 公司)、LX70 倒置顯微鏡(Olympus 公司)、凝膠成像系統(tǒng)(UVP 公司)。

1.3 構(gòu)建孕鼠MXC 染毒模型 孕鼠隨機(jī)分組，每組10 只，分別為MXC 染毒組、正常對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組。依據(jù)文獻(xiàn)［5］，妊娠0.5 ～7.5 d，MXC 染毒組孕鼠皮下注射MXC 166.67mg/(kg·d)，正常對(duì)照組孕鼠皮下注射芝麻油，陽(yáng)性對(duì)照組孕鼠皮下注射雌二醇(1.0 μg)。

1.4 RT－PCR 檢測(cè)胎盤組織中ERα mRNA 表達(dá) 各組孕鼠剖宮產(chǎn)后收集胎盤組織，置入經(jīng)DEPC 處理的EP 管中，于－80 ℃保存待測(cè)。依據(jù)GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)ERα 引物，由上海生物工程技術(shù)公司合成。上游引物:5'－TGT ACC TGC CTA GCA ACA GT－3'，下游引物:5'－GCC ACG TAT CTA AGT CAC CT－3'(450 bp)，內(nèi)參照β－actin 上游引物:5'－GGT GGG AAT GGG TCA GAA GG－3'，下游引物:5'－CCA AGA AGG AAG GCT GGA AAA－3'(671 bp)。應(yīng)用Trizol 方法提取胎盤總RNA，ERα cDNA特異性擴(kuò)增與定量分析應(yīng)用RT－PCR 技術(shù)。擴(kuò)增條件:93 ℃1 min，56 ℃30 s，72 ℃1 min，進(jìn)行1 個(gè)循環(huán);93 ℃30 s，63 ℃30 s，72 ℃1 min，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 ml，5%瓊脂糖凝膠電泳，UVP 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各條帶PCR 產(chǎn)物凝膠電泳的光密度與相應(yīng)β－actin 條帶光密度的比值表示其相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 免疫組化法檢測(cè)胎盤組織中ERα 表達(dá)水平 孕鼠胎盤組織樣本以4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，石蠟包埋，采用冰凍切片機(jī)制備厚度為5 μm的冷凍切片，丙酮－20 ℃固定后置于－80 ℃保存。取上述組織切片，依據(jù)免疫組化方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎盤組織中ERα mRNA 表達(dá) ERα 在各組胎盤組織均有表達(dá)，與正常對(duì)照組ERα mRNA 的相對(duì)表達(dá)量(0.49 ± 0.09)相比，MXC 染毒組ERα mRNA 的相對(duì)表達(dá)量(0.68 ± 0.11)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組ERα mRNA 的相對(duì)表達(dá)量(0.60 ± 0.10)相比，MXC 染毒組ERα mRNA 的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.2 免疫組化結(jié)果 正常對(duì)照組、MXC 染毒組與陽(yáng)性對(duì)照組孕鼠胎盤絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞可見ERα 陽(yáng)性表達(dá)，ERα 為胞核、胞漿陽(yáng)性染色。采用Motic Images Advanced 3.2 (Motic China Group Co，LTD)圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選擇3 個(gè)視野(×200倍)，測(cè)量平均陽(yáng)性面積(μm2)與平均光密度(OD)值，兩者的乘積為免疫組化陽(yáng)性指數(shù)，與正常對(duì)照組相比，MXC 染毒組孕鼠免疫組化陽(yáng)性指數(shù)顯著增加(P ＜0.05，圖1)。

圖1 孕鼠胎盤ERα(免疫組化染色，×200)

3 討論

妊娠期胎盤雌激素的合成對(duì)胚胎的發(fā)育和妊娠的維持具有重要作用，此外雌激素與妊娠期的各個(gè)生理過程包括受精卵著床，以及分娩過程的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。雌激素的生理學(xué)效應(yīng)主要通過ERα 介導(dǎo)，研究發(fā)現(xiàn)卵裂細(xì)胞ERα 在孕鼠胚胎植入與發(fā)育期均有表達(dá)［6］。長(zhǎng)期接觸MXC 可以導(dǎo)致生育能力明顯下降，胚胎發(fā)育早期階段對(duì)MXC 非常敏感，筆者前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，早期持久性暴露MXC，孕鼠子代體重明顯減輕，胎鼠數(shù)明顯減少，子代出生后發(fā)育率明顯降低［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，ERα mRNA 在MXC染毒孕鼠胎盤組織中的表達(dá)明顯增高，提示MXC 主要是以內(nèi)源性雌激素樣方式作用于胎盤ERα。

MXC 可以通過與ERα 的相互作用影響胚胎早期發(fā)育并間接影響胎盤環(huán)境而產(chǎn)生長(zhǎng)期毒性效應(yīng)。MXC 與ERα 結(jié)合后，可以減少內(nèi)源性雌激素與ERα 的結(jié)合，使其不能形成ERα 二聚體，影響與DNA 啟動(dòng)子的雌激素反應(yīng)元件結(jié)合，干擾調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，從而不能產(chǎn)生任何生物學(xué)效應(yīng)，抑制小鼠植入前的胚胎發(fā)育，增加胚胎功能異常情況的發(fā)生比率，導(dǎo)致胚泡凋亡的高發(fā)生率，這可能是MXC 影響胚胎發(fā)育的重要作用機(jī)制之一［7，8］。目前研究發(fā)現(xiàn)，EDCs 還可以通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活ERα 傳導(dǎo)通路［9］，因此對(duì)于MXC 影響胚胎發(fā)育和雌性生殖健康的毒性作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

［1］ Patisaul H B，Adewale H B. Long－term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior［J］. Front Behav Neurosci，2009，3:10－12.

［2］ Tiemann U. In vivo and in vitro effects of the organochlorine pesticides DDT，TCPM，methoxychlor，and lindane on the female reproductive tract of mammals:a review［J］. Reprod Toxicol，2008，25(3):316－326.

［3］ Amstislavsky S Y，Kizilova E A，Golubitsa A N，et al.Preimplantation exposures of murine embryos to estradiol or methoxychlor change postnatal development［J］. Reprod Toxicol，2004，18(1):103－108.

［4］ Amstislavsky S Y，Kizilova E A，Eroschenko V P. Preimplantation mouse embryo development as a target of the pesticide methoxychlor［J］. Reprod Toxicol，2003，17(1):79－86.

［5］ 王曉蓉，陳必良，馬向東，等. 甲氧滴滴涕對(duì)孕鼠及其胎鼠發(fā)育的影響［J］. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(7):634－636.

［6］ Carpenter K D，Korach K S. Potential biological functions emerging from the different estrogen receptors［J］.Ann N Y Acad Sci，2006，1092 :361－363.

［7］ Miller K P，Gupta R K，F(xiàn)laws J A. Methoxychlor metabolites may cause ovarian toxicity through estrogen－regulated pathways［J］. Toxicol Sci，2006，93(1):180－188.

［8］ Gupta R K，Miller K P，Babus J K，et al. Methoxychlor inhibits growth and induces atresia of antral follicles through an oxidative stress pathway［J］. Toxicol Sci，2006，93(2):382－383.

［9］ Gore A C. Neuroendocrine systems as targets for environmental endocrine－disrupting chemicals. Fertil Steril，2008，89(Suppl 2):101－102.