章福彬，朱 斌，唐 郡，劉 衛(wèi) (解放軍第105醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽合肥 230000)

Musashi是一種RNA結(jié)合蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅，在維持干細胞狀態(tài)、分化和腫瘤發(fā)生方面起著重要作用。本實驗通過RNAi技術(shù)調(diào)控人HCT116結(jié)腸癌細胞Musashi-1基因表達水平，并檢測干擾后細胞生物學(xué)行為的改變，探討Musashi-1基因?qū)Y(jié)腸癌細胞增殖及細胞周期的影響，為探討結(jié)腸癌中Musashi基因的功能提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人結(jié)腸癌細胞株HCT116由本實驗室保存，干擾質(zhì)粒載體pGenSil-1購于武漢晶賽公司;Musashi-1 siRNA序列由上海吉凱公司合成，LipofectamineTM 2000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑和AnnexinV凋亡試劑購于Invitrogen公司，總RNA提取試劑(Trizol)和real time PCR試劑盒購于TaKaRa公司。

1.2 Musashi-1siRNA靶序列的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank的Musashi-1 mRNA(NM_002442)全長序列，按siRNA原則設(shè)計，經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫分析未發(fā)現(xiàn)同源序列。設(shè)計基因靶點分別于Musashi-1基因的第205、741位點，靶序CCGGAGTTA。將化學(xué)合成的正義鏈和反義鏈退火，與經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ酶切后線性化pGeneSil-1載體連接，經(jīng)篩選、酶切鑒定后測序。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人結(jié)腸癌細胞株HCT116接種于含10%新生小牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)基中，細胞轉(zhuǎn)染時，取對數(shù)生長期的HCT116細胞，以合適的細胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板，用含10%血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液、37℃、5%CO2溫育過夜，次日轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作按LipofectamineTM 2000 Reagent說明書進行，轉(zhuǎn)染24 h后將轉(zhuǎn)染的細胞按1∶10稀釋，將其種植于另一培養(yǎng)板，再經(jīng)過24 h后，向培養(yǎng)液中加入400 μg/mL的G418進行抗性篩選，2周后熒光顯微鏡下可見細胞克隆發(fā)出熒光，對陽性克隆進行有限稀釋，擴大培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達的細胞株。

1.4 Real time PCR 檢測

按Trizol法提取總RNA，據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法獲得單鏈cDNA，取cDNA作為模板進行Real-time PCR檢測。采用嵌合熒光檢測法，采用50μl反應(yīng)體系(2×SYBR Premix Ex TaqTM 25 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，50 × ROX Reference Dye 1 μl，cDNA，溶液4 μl，DEPCH2O 18 μl)95 ℃預(yù)變性180 s;95℃ 20 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。用 pGEM-Musashi質(zhì)粒和pGEM-GAPDH質(zhì)粒，系列稀釋同時擴增，制作標(biāo)準曲線。記錄各管擴增CT值，換算出基因拷貝數(shù)。以Musashi基因拷貝數(shù)與GAPDH基因拷貝數(shù)的比值作為其相對表達水平，Musashi引物序列為:正義5'-GTTTCGGCTTCGTCACTTTC-3'，反義5'-GAGTCACCATCTTGGGCTGT-3';GAPDH引物序列為:正義5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，反義 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。

1.5 MTT法檢測細胞生長曲線

將轉(zhuǎn)染后的干擾組、空載體組細胞制備成3×103個細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μl，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天取一板進行MTT反應(yīng)，每孔分別加入5 mg/mLMTT 20μl，37℃孵育4 h后棄去上清，每孔均加入二甲基亞砜100μl，輕微振蕩使紫藍色沉淀溶解。用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的吸光度(D)，計算細胞的抑制率。細胞生長抑制率(%)=［(對照組A490 nm－實驗組A490 nm)/對照組A490 nm］×100%。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期

轉(zhuǎn)染后的干擾組、空載體組細胞接種于6孔板中，收集轉(zhuǎn)染后擴增的細胞和空載體組細胞各1×106個，70%冰乙醇固定，碘化丙啶(PI)染色，測定細胞周期情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Musashi siRNA真核表達質(zhì)粒的鑒定及觀察

測序結(jié)果證實插入寡核苷酸序列與設(shè)計的靶點序列完全吻合，說明重組載體構(gòu)建成功。質(zhì)粒中含有編碼GFP的基因，故轉(zhuǎn)染細胞在熒光顯微鏡下可激發(fā)出綠色熒光(圖1)。

圖1 G418抗性篩選后陽性克隆熒光倒置顯微鏡檢測結(jié)果

2.2 Musashi siRNA對HCT116細胞Musashi mRNA表達的影響

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示:siRNA-1組及siRNA-2組的mRNA 相對表達量分別為(0.37±0.040)和(0.33±0.025)，與空載體對照組(0.87 ±0.034)比較，siRNA1 ～siRNA2均可下調(diào)Musashi mRNA的表達，siRNA-1～siRNA-2間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

圖2 Real time PCR檢測結(jié)果

2.3 Musashi siRNA對HCT116細胞增殖的影響

Musashi siRNA 轉(zhuǎn)染 HCT116 細胞后 1、2、3、4 d與對照組比較，siRNA-1、siRNA-2組細胞增殖減慢。細胞轉(zhuǎn)染2 d后的抑制率較1 d顯著增加，但4 d的抑制率較3 d增加不明顯，轉(zhuǎn)染4 d后抑制率較前下降。空載體對照組細胞的抑制率無明顯變化(圖3)。

圖3 Bim-1 RNAi對HCT116細胞增殖的影響

2.4 Musashi siRNA對HCT116細胞周期的影響

與空載體組細胞比較，干擾組細胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，在S期和G2/M期細胞數(shù)下降，以上結(jié)果提示Musashi的RNA干擾可以使HCT116細胞停滯于G0/G1期，明顯抑制HCT116細胞的增殖(P＜0.05)，見表1。

表1 Musashi siRNA 對HCT116細胞周期分布影響±s，%)

表1 Musashi siRNA 對HCT116細胞周期分布影響±s，%)

空載體組45.36 ±4.5640.11 ±3.2414.09 ±6.12 siRNA-180.35 ±4.3315.69 ±2.364.90 ±1.68 siRNA-282.36 ±3.6814.39 ±3.823.78 ±4.71

3 討論

干細胞是一類具有自我更新和增殖分化潛能的原始細胞，近年來提出在腫瘤的瘤體內(nèi)也存在與干細胞具有相似生物學(xué)活性的一類細胞群體，科學(xué)家命名這種存在于腫瘤細胞群體中的特殊細胞為腫瘤干細胞(cancer stem cell)［1］，腫瘤干細胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，它位于腸黏膜隱窩基底部［2］，與腸道腫瘤的形成密切相關(guān)，有研究表明結(jié)腸癌的形成是通過持續(xù)性基因突變產(chǎn)生的，這種基因突變可能發(fā)生在腸道干細胞水平。

結(jié)腸癌是我國常見惡性腫瘤，其預(yù)后不良，早期診斷可以提高患者生存率。作為腸道干細胞的特異性分子標(biāo)記之一的Musashi-1越來越受到人們的重視。人Musashi-1由362個氨基酸組成，N端含有2個保守的RRM(RNA Recognize Domain)結(jié)構(gòu)域。Musashi家族分子能夠在多個層面上決定細胞命運，包括維持干細胞的狀態(tài)、細胞的分化和腫瘤的發(fā)生等［3］。蘇沐等［4］認為正常腸道干細胞標(biāo)記物Musashi-1有可能成為結(jié)直腸癌干細胞樣腫瘤細胞特異性標(biāo)記，龔劍峰等［5］則對Musashi-1啟動子進行了克隆及功能分析，為應(yīng)用該啟動子進行腸道干細胞的分離和純化提供條件。趙曄等［6］采用免疫組織化學(xué)對正常的胃黏膜、小腸黏膜及降結(jié)腸黏膜中musashi-1、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)、Oct-4和Nestin的表達情況進行研究，認為Musashi-1是胃腸道相對特異的干細胞標(biāo)記物。本研究則是構(gòu)建了Musashi-1的兩個siRNA真核表達載體(siRNA-1、siRNA-2)，轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞，運用實時熒光定量測定Musashi-1 mRNA的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA-1、siRNA-2均能抑制Musashi-1的表達，同時應(yīng)用MTT和流式細胞技術(shù)分析細胞的生長曲線和周期分布，發(fā)現(xiàn)Musashi-1siRNA能夠使細胞增殖速度減慢，并使細胞停滯于G0/G1期。

總之，本研究通過使用靶向Musashi-1的siRNA，有效抑制了Musashi-1基因在結(jié)腸癌細胞中的表達，還能在體外特異性抑制結(jié)腸癌細胞的分裂增殖，為探討結(jié)腸癌中Musashi基因的功能提供新的手段。

［1］ Reya T，Morrison SI，Clarke MF，et al .Stem cell，cancer and cancer stem cell［J］.Nature，2001，414(6859):105 － 111.

［2］ Potten CS，Loeffler M.Stem cells:attributes，cycles，spirals，pitfalls and uncertainties lessons for and from the crypt［J］.Development 1990，110(4):1001－1020

［3］ 楊愛萍，姜 藻，陳 靜.Musashi-1、Ki-67的表達與食管鱗癌的臨床意義［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47(32):58 －60.

［4］ 蘇 沐，姜 藻.5-FU對SW480細胞Musashi-1基因表達的影響［J］.東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2007，26(3):198 －201.

［5］ 龔劍鋒，朱維銘，高 翔，等.腸道干細胞特異性表達基因Musashi-1啟動子的克隆及功能分析［J］.腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2006，13(5):257－264.

［6］ 趙 曄，李建生，馬長路.胃腸道干細胞標(biāo)記物的篩選［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2006，15(2):199 －202.