付學(xué)鋒，張新宇，萬東君，林 宏，李柱一 (.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院干三科，甘肅蘭州 730050;.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 70038)

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是細(xì)胞屏障中膜轉(zhuǎn)移通道的蛋白質(zhì)，溶于水并在細(xì)胞和它周圍環(huán)境間運(yùn)動。腦水腫是圍生期缺氧缺血性腦損傷(hypoxicischemic brain damage，HIBD)的病理生理發(fā)生過程中最基本和重要的改變，而水通道蛋白-4(AQP-4)在組織器官水腫發(fā)生的分子機(jī)制中發(fā)揮重要作用［1-3］。我們用大鼠建立HIBD動物模型，檢測大鼠腦組織AQP-4蛋白和AQP-4mRNA表達(dá)情況，以探討AQP-4在HIBD腦水腫病理生理發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

選用體質(zhì)量為210～240 g健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為HIBD模型組和對照組，每組30只。HIBD組采用手術(shù)方法結(jié)扎右頸總動脈進(jìn)行缺氧處理，對照組不結(jié)扎右頸總動脈，其余同HIBD組。于術(shù)后0 h、6 h、1 d、2 d和3 d時間點(diǎn)，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉動物，開胸后，用注射器于左心室注入生理鹽水10 mL，同時剪斷頸外靜脈直至流出液變清，再注入4%多聚甲醛(pH=7.4)10 mL后，立即斷頭取出全腦置于4%多聚甲醛固定7 d后備用。

1.2 方法

將固定后的鼠腦從垂體水平沿冠狀位分成前后兩部分并用全自動脫水機(jī)脫水，石蠟包埋后進(jìn)行冠狀位切片，經(jīng)HE染色后進(jìn)行光鏡觀察病理變化。于0 h、6 h、1 d、2 d和3 d分別取對照組和HIBD腦組織并進(jìn)行適當(dāng)改良提取蛋白備用［4］。采用Western Blot方法測定蛋白，先進(jìn)行蛋白質(zhì)單向SDS凝膠電泳，然后進(jìn)行圖像采集，測定其光密度(IOD)值。目的基因cDNA片斷的擴(kuò)增:引物由上海生物工程公司合成并經(jīng)質(zhì)量檢測，采用上海申能博彩公司的 Two-Step RT-PCR kit，在 PE-9600 PCR儀上進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，得到模板cDNA。熒光定量PCR檢測:制備標(biāo)準(zhǔn)動力學(xué)曲線確定目的基因在腦組織中的表達(dá)，檢測待測樣品的Ct值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

分別用IOD值和Ct值作為AQP-4蛋白和AQP-4mRNA表達(dá)的參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理變化

開顱后，可見HIBD組的右側(cè)腦組織向左膨出，并有腫脹，腦回增寬和腦溝變淺，而對照組無變化。光鏡下觀察結(jié)果見圖1。HIBD組6 h～1 d可見少量神經(jīng)元胞體腫脹，少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，細(xì)胞間隙增寬，2～3 d上述病變更加明顯，同時有細(xì)胞排列雜亂，神經(jīng)元變性，一些神經(jīng)細(xì)胞核固縮且有強(qiáng)嗜堿性，胞質(zhì)紅染加深，膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生，在3 d時可見明顯梗死灶。

2.2 蛋白表達(dá)

與對照組比較，HIBD組腦組織0 h時AQP-4蛋白表達(dá)無變化，6 h后開始逐漸下降，其中2 d下降明顯，3 d后開始回升。HIBD在6 h、1 d、2 d和3 d各時間點(diǎn)IOD值均較對照組低，結(jié)果見表1。

2.3 AQP-4mRNA 表達(dá)

常規(guī)PCR測定AQP4mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物，腦組織中各時間點(diǎn)AQP-4mRNA表達(dá)結(jié)果見表2，結(jié)果顯示0 h變化不明顯，6 h、1～3 d均較對照組低，2 d時最低，3 d開始回升。

3 討論

腦創(chuàng)傷、腦腫瘤和腦缺血繼發(fā)性腦水腫的病理生理過程均有AQP-4參與［5-7］。無AQP-4基因大鼠腦缺血引起的腦水腫不明顯，提示抑制AQP-4表達(dá)可能達(dá)到治療腦水腫的目的［6-9］。腦組織周圍的缺血缺氧可破壞血腦屏障，導(dǎo)致細(xì)胞外大量興奮性谷氨酸的積累，從而激活谷氨酸受體引起大量Ca2+的細(xì)胞內(nèi)流，促使Ca2+敏感酶活性增加，產(chǎn)生大量自由基導(dǎo)致線粒體損傷，細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死［10］。艾芬地爾和硫酸鎂可減輕谷氨酸對血腦屏障的破壞，下調(diào)AQP-4的表達(dá)，使局灶性缺血和創(chuàng)傷性腦損傷面積減少，減輕腦水腫，從而認(rèn)為減輕水腫可能是通過下調(diào)AQP-4表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

圖1 HIBD不同時間AQP-4表達(dá)的免疫組化染色(×400)

表1 腦組織AQP-4蛋白條帶的IOD值(±s，n=6)

表1 腦組織AQP-4蛋白條帶的IOD值(±s，n=6)

*:與對照組比較，P ＜0.01

表2 腦組織AQP-4mRNA表達(dá)±s，n=6)

表2 腦組織AQP-4mRNA表達(dá)±s，n=6)

*:與對照組比較，P ＜0.01

AQP-4在保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)水、電解質(zhì)平衡中起重要作用［8-10］。我們發(fā)現(xiàn) HIBD早期 AQP-4表達(dá)減少，3 d后AQP-4表達(dá)出現(xiàn)回升趨勢，這一過程同時伴有腦損傷、腦水腫改變，提示大鼠HIBD腦水腫與腦組織中AQP-4表達(dá)有一定關(guān)系，AQP-4可能對HIBD腦水腫的發(fā)生發(fā)展起調(diào)控作用［1-3］。腦組織缺氧缺血時AQP-4表達(dá)降低，多數(shù)研究認(rèn)為AQP-4可能通過調(diào)節(jié)依賴蛋白激酶C和A(PKC，PKA)而發(fā)揮作用。腦組織缺血缺氧時，通過氧化磷酸化和激活PKC和PKA使AQP-4磷酸化失活、表達(dá)降低［10］。PKC和 PKA被激活后，可從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞膜，并使AQP-4蛋白磷酸化，這時水的滲透性發(fā)生改變，形成或加重腦水腫。但真正的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

［1］ 趙應(yīng)敏，宋 波，許予明.AQP4與腦水腫［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，6(5):164 －165.

［2］ 摩馭國.水通道蛋白4在大鼠外傷性腦損傷的表達(dá)及意義［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，30(6):7 －8.

［3］ 譚美蕓.水通道AQP1的研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2010，5(9):241－243.

［4］ 張志燈，曹治云，鄭 騰，等.改良的大鼠腦組織總RNA抽提方法［J］.生物技術(shù)通訊，2006，17(5):760 －761.

［5］ 何 玲，王 鍵，胡建鵬.活血利水法對大鼠缺血性腦水腫腦組織內(nèi)AQP-1和AQP-9表達(dá)的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2011，20(4):580－581.

［6］ 陳寶智，王宇田，趙建農(nóng)，等.顱腦外傷早期與AQP4表達(dá)的研究進(jìn)展［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2010，10(3):380 －381.

［7］ Zhang YW，Li HT，Hu J，et al.Correlation analysis between the expression of aquaporin 4 and magnetic resonance imaging of brain tissue in severely scalded rabbit with brain edema during early stage［J］.Zhonghua Shao Shang Za Zhi，2011，27(6):441 －445.

［8］ 孟 飛，衣服新，葉志軍，等.艾芬地爾對大鼠局灶性腦缺血損傷后腦水腫和AQP4表達(dá)的影響［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2010，26(2):192－196.

［9］ 李 琴，張 紅，畢明俊，等.神經(jīng)調(diào)節(jié)素對大鼠腦缺血再灌注損傷AQP-4及GFAP表達(dá)的影響［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2009，25(1):30－36.

［10］ Wang LQ，Zhu SM，Zhou HJ，et al.Expression of aquaporin-4 during brain edema in rats with thioacetamide-induced acute encephalopathy［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2011，91(36):2573 － 2577.