吳向遠，丁 冬，宋桂良，付志遠

(河南農業(yè)大學農學院，河南 鄭州 450002)

基因克隆、種子純度檢驗、分子標記輔助選擇育種等目標的實現(xiàn)都離不開分子標記技術的發(fā)展［1～4］，而分子標記的廣泛應用要以高效、快速的基因組DNA 提取為前提和保證.在植物基因組DNA 提取方法中，SDS和CTAB［5］是2種經典有效的方法，能夠得到大量的高質量DNA，但其提取步驟復雜、耗時。隨后產生了用切除的部分胚乳通過NaOH 裂解法提取基因組DNA，該方法雖然能夠達到批量樣品基因組DNA快速提取且保持種子活力的目的，但得到的DNA 無法長期保存［6］.為解決這一問題，本研究以玉米回交世代群體單粒種子胚乳和單株葉片為材料，以十二烷基肌氨酸鈉(SLS)，Tris-HCl，EDTA(乙二胺四乙酸)和NaCl為主要試劑，結合電鉆和液氮研磨，分析了其提取效果，并探討了其在玉米種子純度檢驗和分子標記輔助育種應用中的可行性.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以雜交種鄭單958 及其親本自交系鄭58和昌7-2為種子純度檢驗材料，以3000株(綜3×許178)× 許178的BC1分離群體為分子標記分析材料.

1.2 試驗方法

1.2.1 單粒種子胚乳DNA 提取 選取96 粒干種子，超純水浸泡20 min.

2)用手術刀片輕輕剝開種皮，剝取微量胚乳放入PCR 板中.

3)加入100μL NaOH 溶液(0.2 mol·L-1，pH值=8.0)，蓋上與PCR 板對應的硅膠墊，放入PCR儀中，100℃溫育15 min.

4)取出PCR 板后，加入等體積TE 溶液(pH值=2.0)并吸取上清液，冷卻10 min.

5)用質量分數0.8%瓊脂糖電泳檢測或直接用于PCR 擴增;不用時用保鮮膜密封于4℃冰箱保存(不能超過14 d).

1.2.2 單葉片DNA 提取

1)取微量玉米葉片于2.0 mL的離心管中，用系有細繩的小夾子夾住離心管管蓋，放入液氮缸中速凍5 s.

2)迅速從液氮缸中提出離心管，用插有玻璃棒的電鉆將離心管中冷凍的葉片迅速研磨成粉末(速度要快，以防降解).

3)加入800μL 質量分數1%SLS 提取液(100 g·L-1SLS，0.2 mol·L-1EDTA，1 mol·L-1NaCl，1 mol·L-1Tris-HCl)，充分混勻(2～5 min).

4)加入1 mL的V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1，充分混勻(2～5 min).

5)10000 r·min-1離心5 min，取上清液于1個新的2 mL 離心管中.

(6)向上清液中加入與上清液等體積預冷的異丙醇，沉淀DNA.

(7)10000 r·min-1離心5 min，棄上清液，并用體積分數75%乙醇洗滌DNA.

(8)DNA 干燥后用滅菌水溶解.

(9)在質量分數0.8%瓊脂糖電泳檢測或直接用于PCR 擴增.

1.2.3 PCR 反應體系和反應程序 反應總體積15μL，包括10×PCR Buffer(含20 mol·L-1Mg2+)1.5μL，NTPs(2.5 mmol·L-1)0.3μL，Taq 酶(5 U·μL-1)0.1μL，引物(50 mg·L-1)1.5μL，DNA(20 mg·L-1)3.0μL，ddH2O 8.6μL.反應液混合后，用20μL的石蠟油覆蓋，以防反應液蒸發(fā).PCR 擴增程序為PCR 反應在PTC-200PCR 反應儀上進行.

PCR 反應程序為:95℃預變性2 min，95℃變性1 min，65℃(-1℃/cycle)退火1 min，72℃延伸1.5 min共7個循環(huán);95℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共28個循環(huán);72℃延伸10 min，待溫度降至4℃時取出.擴增產物用質量分數6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染程序參考李曉輝等［8］的方法.

2 結果與分析

2.1 DNA 樣品凝膠電泳檢測

基因組DNA 提取后，在NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 核酸測定儀上測定DNA 質量濃度.2種方法提取的樣品DNA的A260/A280比值均為1.8～2.0，在260 nm 處的吸收峰曲線穩(wěn)定，粗提的DNA 得率在250～400 mg·L-1.在瓊脂糖凝膠上對提取的DNA 進行電泳檢測，NaOH 裂解法(圖1)對玉米單粒種子胚乳的DNA 提取效果較十二烷基肌氨酸鈉法對玉米葉片的DNA 提取效果(圖2)稍差，雜質較后者多，但2種方法得到的基因組DNA 均有清晰的主帶，對普通的SSR 反應都有效.

圖1 NaOH 裂解法提取的玉米子粒胚乳DNAFig.1 Electrophoresis map of amplified DNA from maize endosperm

2.2 單粒種子胚乳NaOH 裂解法和改良SLS 法所得DNA 應用的比較

用單粒種子胚乳NaOH 裂解法快速提取玉米雜交種鄭單958 及親本自交系鄭58和昌7-2的DNA，并利用自己保存的SSR 引物，選取了在親本間有遺傳多態(tài)性的2 對引物phi 116和bnlg 1450對鄭單958 雜交種的純度進行了檢測(圖3).無論在雜交種中，還是親本中，2 對引物擴增條帶都十分清楚，完全可以達到檢驗種子純度的目的.

同理，對采用改良SLS 法提取的(綜3× 許178)×許178的BC1回交群體DNA 進行了標記分析，篩選了在綜3和許178 間存在多態(tài)性的SSR 標記.圖4為引物bnlg 1191 對BC1回交群體檢測的部分單株DNA分子帶型.由圖4可見，回交群體個體間的多態(tài)性分離明顯，目的條帶清晰，完全可以實現(xiàn)對特定DNA片段進行擴增的要求.

3 討論

目前，SSR 標記技術已被用于種質鑒定、種子純度分析、遺傳圖譜構建、基因定位及標記輔助選擇等研究領域［7～9］.無論是鑒定，還是對分離群體目標性狀及時的前期選擇，都涉及批量、大規(guī)模樣本基因組DNA的提?。?0，11］.如何高效、快速地提取基因組DNA 已成為分子標記技術應用于玉米育種研究的首要限制因素.本研究為探索解決這一問題的途徑，對已有的從玉米單粒種子胚乳中提取DNA的方法［12，13］進行了優(yōu)化，并提出了從玉米單葉片中快速提取玉米基因組DNA［14］的改良實用方法.與傳統(tǒng)CTAB 法和SDS 法相比，本研究所用的2種方法都用電鉆粉碎取代了手工研磨，節(jié)約了勞動力和成本.盡管SLS 比SDS 價格高，但該方法步驟簡單，節(jié)約了時間，提高了效率，比傳統(tǒng)方法的提取效率提高了2～3倍，1 d 內可提取600～800份樣品的DNA.與傳統(tǒng)方法相比，NaOH 裂解法同樣可以達到快速提取基因組DNA的目的.用NaOH 裂解法提取玉米單粒種子胚乳DNA 僅有簡單的2 步，1 人·d-1很容易提取1000份，尤其遇到圖位克隆中涉及大群體樣品DNA 提取時，該方法更為高效、快捷.但與SLS 法相比，該方法提取的基因組DNA 不易于長期保存，也無法用于后續(xù)的DNA 純化和測序工作.盡管2種方法各有優(yōu)點，但是都可以作為目前最經濟、高效、便捷的DNA 提取方法，可以有效滿足玉米品種純度鑒定和分子標記輔助育種的需求.

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