張媛媛 趙 敏 張 寧

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

社會(huì)呼喚綠色、安全的食品，而飼料安全更是食品安全的前提。有理由相信，動(dòng)物飼料中大量使用益生菌制劑的時(shí)代已經(jīng)來臨［1］。芽孢桿菌制劑是一種常用高效益生菌添加劑?？莶菅挎邨U菌作為芽孢桿菌屬的模式種具有很多優(yōu)點(diǎn)，包括耐酸、耐鹽、耐高溫(100℃)及耐擠壓等特性，因而在飼料的加工、貯藏以及通過動(dòng)物胃腸道酸性環(huán)境等的過程中具有較高的穩(wěn)定性［2］。此外它還具有很強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，對(duì)植物性碳水化合物具有較強(qiáng)的降解能力，可促進(jìn)機(jī)體對(duì)食物的消化吸收［3］。而凝結(jié)芽孢桿菌更是一種具有廣闊發(fā)展前景的益生菌，它不但具有芽孢桿菌的優(yōu)點(diǎn)，更兼具乳酸菌的特性，有效地添補(bǔ)了乳酸菌制劑和雙歧桿菌制劑耐性差、培養(yǎng)及儲(chǔ)存條件苛刻等方面的缺陷［4－5］。Adami and Cavazzoni［6］發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)仔豬糞中的微生物區(qū)系有明顯的影響，且這種益生菌有利于改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能。因此，本研究選取二者進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，充分考慮到二者的共性和特性，培養(yǎng)基配方也采用了成本低廉且適用于工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵原料，以期在動(dòng)物飼養(yǎng)中獲得更顯著的效果并帶來更可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料

菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtili)1.892，購自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)1.200 9，購自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，酵母浸出物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH=7.2 ～7.5，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 4 g/L，pH=7.2 ～7.5，121 ℃滅菌20 min;計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:LB瓊脂培養(yǎng)基。

主要試劑 工業(yè)用廢糖蜜(哈爾濱英瑞斯飼料有限公司提供，含糖量為570 g/L)，玉米粉(市售，GB/T 8885—2008)，豆粕粉(哈爾濱英瑞斯飼料有限公司提供，含氮量為76.3 g/L)，玉米漿(哈爾濱英瑞斯飼料有限公司提供，含氮量35.8 g/L)，瓊脂(生物試劑，北京索來寶科技有限公司);葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖、尿素、NH4Cl、OXOID酵母浸粉(生物試劑，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司)、蛋白胨、MgSO47H2O、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、CaCO3、氯化鈣(均為分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)。

儀器設(shè)備 FLC—3CLEAN BENCH超凈工作臺(tái)(哈爾濱市東聯(lián)公司)，DGX—9243B—1電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，HZQ—F160型振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，MLS—3020高壓滅菌鍋(SANYO Electric Co.Ltd.)，HAIER BCD—237F電冰箱(青島海爾電冰箱股份有限公司)，HZQ—F160A型恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，PHS—3S精密PH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)方法

①菌種活化:將保存于斜面的兩株菌種分別轉(zhuǎn)接到新鮮的LB斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h，置于冰箱中4℃保存，備用。

②種子液的制備:取20 mL種子培養(yǎng)基于100 mL三角瓶中，滅菌后各接入一環(huán)活化的菌種，37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)18 h。

③搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):取100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中，滅菌后接入兩種芽孢桿菌各1.5 mL(總接種量為3%)。將三角瓶置37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

2.2 培養(yǎng)基成分的單因子試驗(yàn)

碳源:分別用20 g/L的廢糖蜜、玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖、廢糖蜜+玉米粉(m(廢糖蜜)∶m(玉米粉)=1∶1)等量替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，制成培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。24 h后檢測(cè)活菌數(shù)，確定最佳碳源。

氮源:分別用10 g/L的尿素、豆粕粉、NH4Cl、酵母浸粉、豆粕粉+NH4Cl(m(豆粕粉)∶m(NH4Cl)=1∶1)、玉米漿、(NH4)2SO4等量替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，制成培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。24 h后檢測(cè)活菌數(shù)，確定最佳氮源。

無機(jī)鹽:分別用4 g/L的硫酸鎂、磷酸二氫鉀(2 g/L)+磷酸氫二鉀(2 g/L)、氯化鈣、硫酸亞鐵、碳酸鈣等量替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氯化鈉，制成培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。24 h后檢測(cè)活菌數(shù)，確定最佳無機(jī)鹽。

最佳碳源質(zhì)量濃度:在確定最佳氮源和最佳無機(jī)鹽的含量不變的條件下，分別取質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60 g/L 的碳源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，24 h后檢測(cè)活菌數(shù)，以確定最佳碳源的質(zhì)量濃度。

最佳氮源質(zhì)量濃度:在確定最佳碳源和最佳無機(jī)鹽的含量不變的條件下，分別取質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60 g/L 的氮源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，24 h后檢測(cè)活菌數(shù)，以確定最佳氮源的質(zhì)量濃度。

最佳無機(jī)鹽質(zhì)量濃度:在確定最佳碳源和最佳氮源的含量不變的條件下，分別取質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10、12 g/L 的無機(jī)鹽進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，24 h 后檢測(cè)活菌數(shù)，以確定最佳無機(jī)鹽的質(zhì)量濃度。

上述各試驗(yàn)均作3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

2.3 正交試驗(yàn)

將單因子試驗(yàn)篩選出的最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽，按照L9(3)4正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，每試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。正交試驗(yàn)因素及其水平見表1。

表1 L9(34)正交設(shè)計(jì)因素表 g·L－1

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化出的培養(yǎng)基配方，在保證發(fā)酵過程中其他發(fā)酵條件不變的情況下，對(duì)最佳培養(yǎng)時(shí)間、溫度、初始pH值、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量進(jìn)行逐一優(yōu)化。每一試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

采用平板稀釋涂布法［7］進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

采用正交設(shè)計(jì)助手II對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

3.1.1 不同碳源對(duì)復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

以m(廢糖蜜)∶m(玉米粉)=1∶1的比例混合發(fā)酵時(shí)，復(fù)合益生菌芽孢桿菌的活菌數(shù)最高，達(dá)到7.71×109CFU/mL;其次是廢糖蜜，活菌數(shù)達(dá) 6.43×109CFU/mL，二者均高于基礎(chǔ)碳源葡萄糖的活菌數(shù)為6.04×109CFU/mL;而其余碳源的活菌數(shù)均低于基礎(chǔ)碳源葡萄糖(表2)。廢糖蜜、玉米粉作為碳源不但活菌數(shù)高且價(jià)格低廉，發(fā)酵成本低，適用于規(guī)?；a(chǎn)。

3.1.2 不同氮源對(duì)復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

豆粕粉作為氮源時(shí)，復(fù)合益生菌芽孢桿菌的活菌數(shù)最高，達(dá)到6.06×109CFU/mL;其次是基礎(chǔ)氮源蛋白胨，活菌數(shù)達(dá)5.74×109CFU/mL(表2)。其中，無機(jī)氮源的活菌數(shù)均明顯低于有機(jī)氮源，可見芽孢桿菌對(duì)有機(jī)氮源的利用率更高，更適合其生長(zhǎng)。選擇復(fù)合芽孢桿菌生長(zhǎng)的最佳氮源為豆粕粉。

3.1.3 不同無機(jī)鹽對(duì)復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

分別以m(磷酸氫二鉀)∶m(磷酸二氫鉀)=1∶1和氯化鈣作為無機(jī)鹽發(fā)酵時(shí)，活菌數(shù)均高于基礎(chǔ)無機(jī)鹽氯化鈉，前兩者活菌數(shù)分別為5.63×109CFU/mL和 5.02×109CFU/mL，而氯化鈉為 4.96×109CFU/mL(表2)。其他無機(jī)鹽活菌數(shù)均小于氯化鈉。故選擇m(磷酸氫二鉀)∶m(磷酸二氫鉀)=1∶1和氯化鈣作為最佳無機(jī)鹽。

表2 不同培養(yǎng)基成分對(duì)復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長(zhǎng)的優(yōu)化結(jié)果

3.1.4 最佳碳源的不同質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

最佳碳源的不同質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合芽孢桿菌的生長(zhǎng)存在一定的影響，選擇質(zhì)量濃度低的碳源時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的逐漸增加，活菌數(shù)也不斷提高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到3%時(shí)，活菌數(shù)最高，為5.66×109CFU/mL。其后隨著最佳碳源不同質(zhì)量濃度的進(jìn)一步提高，活菌數(shù)逐步緩慢下降并趨于平穩(wěn)(表3)。故選擇3%時(shí)的碳源為最佳碳源含量。

3.1.5 最佳氮源的質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

當(dāng)?shù)吹馁|(zhì)量濃度較低時(shí)，對(duì)復(fù)合芽孢桿菌活菌數(shù)的影響并不明顯，但隨著氮源質(zhì)量濃度的不斷提升，當(dāng)?shù)吹馁|(zhì)量濃度達(dá)到4%時(shí)，芽孢桿菌活菌數(shù)提高到1.02×1010CFU/mL之后緩慢遞減(表3)。故選擇4%時(shí)的氮源為最佳氮源含量。

3.1.6 最佳無機(jī)鹽的質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

最佳無機(jī)鹽所選取的6種不同的質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合芽孢桿菌活菌數(shù)的影響并不顯著，均能達(dá)到6.0×109CFU/mL左右。隨著最佳無機(jī)鹽質(zhì)量濃度的逐漸增大，活菌數(shù)基本保持平穩(wěn)，變化幅度不大(表3)，故選取最低的質(zhì)量濃度為0.2%的最佳無機(jī)鹽便可以滿足芽孢桿菌正常的生長(zhǎng)代謝。

表3 最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽的不同質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長(zhǎng)的優(yōu)化結(jié)果

3.1.7 正交試驗(yàn)

對(duì)單因子試驗(yàn)優(yōu)化出來的各營(yíng)養(yǎng)成分做進(jìn)一步優(yōu)化，采用L9(3)4正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以期找到培養(yǎng)基成分中碳源、氮源、無機(jī)鹽之間的最佳配比，結(jié)果見表4。

表4 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)表

正交試驗(yàn)優(yōu)化出的最佳組合為A2B2C1D2，由于該組合并不在以上正交試驗(yàn)所列的9次試驗(yàn)范圍內(nèi)，故對(duì)正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合進(jìn)行了驗(yàn)證性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示:對(duì)A2B2C1D2組合的3次試驗(yàn)結(jié)果取平均值，活菌數(shù)達(dá)6.370×1010CFU/mL，高于9次試驗(yàn)中的最高活菌數(shù)5.931×1010CFU/mL。故復(fù)合芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基配方為廢糖蜜15 g/L、玉米粉 15 g/L、豆粕粉 40 g/L、KH2PO41 g/L、K2HPO41 g/L、氯化鈣2 g/L。極差分析得 RA＞RB＞RC＞RD，可知各因素對(duì)復(fù)合芽孢桿菌活菌數(shù)的影響大小依次為:廢糖蜜＞豆粕粉＞磷酸鹽＞氯化鈣。對(duì)正交試驗(yàn)的方差分析表明(表5)，廢糖蜜、豆粕粉為顯著影響因子，無機(jī)鹽為不顯著影響因子，故選取較低質(zhì)量濃度的無機(jī)鹽方可滿足益生菌生長(zhǎng)的需求。

表5 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

3.2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

按試驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)基配方對(duì)種子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為32 h。自接種后每2 h取樣1次測(cè)定菌液的OD600nm，未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，結(jié)果見圖1。由圖1可知，種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基后，0～6 h為生長(zhǎng)的延滯期;6～16 h為對(duì)數(shù)期，菌體數(shù)量急劇增多;18 h以后為芽孢桿菌的相對(duì)穩(wěn)定期?？梢姀?fù)合芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)選在18～26 h之間。

圖1 復(fù)合益生菌芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線

3.2.2 初始溫度對(duì)復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

溫度主要通過改變酶反應(yīng)速率來影響菌體的生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)基溫度的升高，酶促反應(yīng)的速率也隨之增大，代謝水平加快。但溫度過高會(huì)引起酶類失活，表現(xiàn)為菌體迅速衰老，導(dǎo)致活菌數(shù)大幅度降低，影響產(chǎn)量。試驗(yàn)選取25、30、35、40、45、50 ℃作為搖床溫度，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h，運(yùn)用平板稀釋涂布法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，確定不同溫度對(duì)復(fù)合芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度為35～40℃時(shí)，活菌數(shù)較高，且以37℃時(shí)為最高，活菌數(shù)可達(dá)3.73×1010CFU/mL(表6)。

3.2.3 初始pH值對(duì)復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

pH值主要通過影響菌體細(xì)胞膜電荷、膜滲透性以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)離子化的程度，從而影響菌體對(duì)養(yǎng)分的吸收。由于搖瓶過程中的pH值難以控制，只能控制發(fā)酵液的初始pH值。因此本試驗(yàn)將最佳培養(yǎng)基配方的初始 pH 分別調(diào)至 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h后測(cè)其活菌數(shù)。復(fù)合芽孢桿菌在初始pH值為7.0～8.0范圍內(nèi)的活菌數(shù)較高，且以pH=7.5時(shí)為最高，活菌數(shù)可達(dá)5.69×1010CFU/mL(表6)。

3.2.4 接種量對(duì)復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

接種量的多少與菌株生長(zhǎng)周期的長(zhǎng)短有關(guān)，不同接種量對(duì)復(fù)合芽孢桿菌活菌數(shù)影響較大，接種量過高或過低均會(huì)影響活菌數(shù)的水平。接種量低，延滯期過長(zhǎng)，造成培養(yǎng)周期延長(zhǎng)，耗費(fèi)大量時(shí)間;接種量高，細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的競(jìng)爭(zhēng)力過大，造成菌體因營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足而提前死亡，同樣會(huì)抑制活菌數(shù)的提高，故試驗(yàn)選取2%、4%、6%、8%、10%、15%的接種量進(jìn)行接種，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h后測(cè)其活菌數(shù)。接種量為8%時(shí)，復(fù)合芽孢桿菌的活菌數(shù)達(dá)最高，為3.42×1010CFU/mL(表6)?？梢姀?fù)合芽孢桿菌的最佳接種量為8%。

表6 不同發(fā)酵條件對(duì)復(fù)合芽孢桿菌生長(zhǎng)的優(yōu)化結(jié)果

3.2.5 裝液量對(duì)復(fù)合芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

裝液量的大小主要反映搖瓶?jī)?nèi)溶氧量的多少，裝液量越小，瓶?jī)?nèi)溶氧則越多。在250 mL三角瓶中分別裝入最佳培養(yǎng)基，使得裝液量分別為30%、35%、40%、45%、50%、55%，搖床發(fā)酵培養(yǎng)24 h后測(cè)其活菌數(shù)。采用40%的裝液量時(shí)活菌數(shù)最高，為3.84×1010CFU/mL，但隨著裝液量的增大，活菌數(shù)不斷下降(表6)?？梢娙苎跛皆礁?，則越適合需氧的復(fù)合芽孢桿菌生長(zhǎng)。在實(shí)際生產(chǎn)中，可以根據(jù)實(shí)際情況，酌情掌握裝液量的大小，盡可能使溶氧量增加。

3.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)復(fù)合芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)復(fù)合芽孢桿菌發(fā)酵的活菌數(shù)存在一定的影響。隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大，活菌數(shù)得到顯著提高，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到160 r/min時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高，為 4.53×1010CFU/mL(表6)，但進(jìn)一步提高搖床轉(zhuǎn)速，活菌數(shù)則開始逐漸下降，可能由于轉(zhuǎn)速過高會(huì)加快細(xì)菌菌體的裂解所致。故選定160 r/min為復(fù)合芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)的搖床轉(zhuǎn)速。

4 結(jié)論

采用單因子試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，在搖瓶中對(duì)復(fù)合芽孢桿菌的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，通過平板稀釋涂布法測(cè)定培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)，以活菌數(shù)的高低作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到最優(yōu)培養(yǎng)基配比為:廢糖蜜15 g/L、玉米粉 15 g/L、豆粕粉 40 g/L、KH2PO41 g/L、K2HPO41 g/L、氯化鈣2 g/L。通過單因子試驗(yàn)確定了最佳培養(yǎng)條件［8］為:起始 pH=7.5、溫度 37 ℃、接種量8%、裝液量40%、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。通過對(duì)復(fù)合芽孢桿菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化后，活菌數(shù)得到顯著提高，達(dá)到6.62×1010CFU/mL。明顯高于崔東良等［9］對(duì)單株凝結(jié)芽孢桿菌工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)基初步研究所得的活菌數(shù)9.3×109CFU/mL，且成本低廉，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

本試驗(yàn)僅是在實(shí)驗(yàn)室搖床培養(yǎng)條件下進(jìn)行的優(yōu)化，還需在生產(chǎn)用發(fā)酵罐中做進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)中各項(xiàng)發(fā)酵參數(shù)的設(shè)定，也需要做更詳盡的研究。

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